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史成军 何蕴韶
[摘要] 膀胱癌的诊断和治疗主要依靠对肿瘤生物学行为进行精确评价， 随着分子生物学和细胞遗传学的发展，鉴定和描述反映TCC病人预后标志物的研究越来越多。肿瘤分子生物学变化可分为三个相互作用的过程：（1）染色体异常导致肿瘤形成；（2）细胞过度增殖导致细胞周期调控失控；（3）生长控制过程中新血管生成导致肿瘤转移。这些变化长期累积最终决定肿瘤的临床过程。因此，了解和研究膀胱癌新的分子标志物的进展，将对膀胱癌的诊断和治疗提供新的前途。
[关键词] 膀胱癌; 肿瘤标志物; 癌基因; 抑癌基因; 血管生成
膀胱癌在中国居泌尿系统肿瘤之首，多见于男性，男女比例约为3︰1，大多来源于上皮细胞，占95%以上，其中90%以上为移行细胞癌（transitional cell carcinoma,TCC），鳞状细胞癌和腺癌较少见。依据组织病理学检查和临床表现将TCC分为表浅型和侵袭型两类，80%的早期TCC病人表现为无痛、低分化且局限于黏膜层。大部分病人可通过手术和化疗或放疗进行治疗，但其复发率高达70%，2年内复发和转移率高达50%[1]。目前，膀胱癌的治疗策略主要依据组织病理学检测，肿瘤分期分级作为主要的预后指标，尽管可提供某种程度的预后信息，对复发和生存率有一定意义，但仍然有许多不足[2]。因此，了解和研究膀胱癌新的分子标志物进展将对膀胱癌的诊断和治疗提供新的前途。本文从染色体异常、细胞周期调控失控和新血管生成三方面归纳了新近反映膀胱癌预后的分子标志物，并对其应用作一综述。
1 染色体异常
染色体异常导致癌基因和抑癌基因功能的改变。癌基因通过正常基因产物的过表达，或者表达一种功能异常的蛋白质致癌；而抑癌基因通过失活机制致癌。细胞的生长增殖是癌基因的促进作用与抑癌基因的抑制作用相互影响的结果。
1.1 癌基因
癌基因是正常的细胞基因，能够受各种各样的遗传因素而改变，如点突变、插入/缺失突变、易位、等位基因丢失等，从而导致恶性基因型的出现。通过正常基因产物的过表达，或者表达一种功能异常的蛋白质，前者包括基因扩增或染色体从一强启动子易位至下游，后者突变蛋白产物的表达导致分子生长调控机制的功能紊乱。目前认为与膀胱癌有关的比较重要的癌基因主要有cH-ras、c-myc、HER2/neu 和FGFR3等。近几年来，膀胱癌基因的研究取得了很大的进展。
1.1.1 cH-ras基因 ras家族包括N-ras、K-ras和H-ras，前两者在膀胱癌中很少发生突变，已经发现在膀胱癌的发生发展中存在H-ras基因突变。H-ras编码G蛋白，参与信号传导。突变后，细胞过度增殖，失去细胞GTP水解活性。已经发现20%的膀胱癌H-ras基因突变点在12和61密码子，而且12密码子单点突变（G→A）比较频繁，常导致H-ras基因过度活跃。新近发现，H-ras过表达增加了膀胱癌细胞对5-FU的敏感性，且H-ras在癌细胞凋亡中起重要作用[4]。
1.1.2 c-myc 基因 myc家族位于染色体8q，编码细胞核磷蛋白，参与转录后调节，具有DNA结合活性，对调控细胞增殖非常重要。c-myc与其它蛋白质（Mad和Max）相互作用，形成异二聚体从而发挥其调控活性。染色体异位和基因扩增导致myc基因家族异常，从而促进细胞增殖[5]。
Kotake等[5]研究证明 c-myc蛋白的表达与膀胱癌的分级有关；而Lipponen等[6]发现myc蛋白的表达与TCC病人的预后无关。因此，c-myc 基因在膀胱癌中表达的真正预后作用需要进一步研究证实。
1.1.3 HER2/neu（erbB-2）基因 HER2/neu位于染色体17q21，编码185KD的跨膜糖蛋白（p185），它是一个由1255个氨基酸组成的酪氨酸激酶受体，有酪氨酸激酶活性。该基因与表皮生长因子受体（EGFR）类似，能够刺激细胞生长和分裂[7]。研究发现HER2/neu基因的表达与肿瘤的高分期、肿瘤进展、高转移率和减少生存时间有关，表明HER2/neu的表达水平对判断膀胱癌预后起重要作用。然而，其他报道发现HER2/neu提供的预后信息没有超过传统组织病理学对TCC病人的分期分级[8]。
1.1.4 FGFR3基因 FGFR3是最新发现的基因，位于4P16.3，由19个外显子组成，是成纤维细胞生长因子受体家族成员之一。编码区的突变可导致氨基酸组成的改变，从而使受体持续活化。FGFR3在TCC中常发生突变，且与肿瘤的分期分级无关，表明FGFR3的持续活化可能在膀胱癌的发生中起重要作用[9]。
1.2 抑癌基因
目前已经鉴定出几个潜在的与膀胱癌有关的抑癌基因，研究发现染色体3p和8p缺失与肿瘤的高分期和肌侵袭型TCC有关。在肌侵袭型膀胱癌8p缺失高达50%，而表浅型中未发现有8p缺失[10]。
与膀胱癌有关的染色体异常最常见的是9号染色体大片段缺失，实际上 这种改变代表了TCC分子发病机制的早期现象，在表浅型和肌侵袭型TCC中均发现了9号染色体缺失[11]。9号染色体不同部位的序列删除在膀胱癌发展过程中可能非常重要，有研究显示这种删除与吸烟有关[12]。
其他染色体缺失包括13号染色体和17号染色体。
9号染色体缺失大部分位于染色体9p21(INK4α/ARF和INK4β)，该区编码3种不同的蛋白：p16INK4α、P14ARF、P15 INK4β，每种蛋白对细胞周期进行负调控。新近研究表明，将p16INK4α体外转染至INK4删除的膀胱癌细胞株，发现生长受抑制，说明9p21位点具有肿瘤抑制功能 [13]。p16INK4α、P14ARF和P15 INK4β蛋白可能作为恶性程度的标志物[14]。
13号染色体RB基因被认为在膀胱癌的发展过程中起重要作用，该基因在25%—30%的膀胱肿瘤中发生突变，RB位点纯合子丢失与RB蛋白的表达有关[15]。由于该基因非常大，目前仍不能应用DNA测序或SSCP技术进行分析，因此，RB基因的潜在作用和特定突变分析目前仍然受到一定限制。
17号染色体p53目前已经得到确认，17p纯合子高频率丢失与TCC的高分化密切相关。p53位点的先天性缺陷与突变的p53基因的表达产物一致。
2 细胞周期调控途径——抑癌基因
正常的细胞周期进展和调控的紊乱导致肿瘤增殖，正常的细胞增殖受细胞周期相关蛋白复合体（包括细胞周期蛋白及其依赖激酶-Cdks）调控。几种抑癌基因及其蛋白产物p16INK4α、P14ARF、p53、pRb和P15 INK4β在G0/G1期阻止细胞周期调控丢失，最终阻止肿瘤形成。
突变、删除、甲基化均可导致基因改变，但是，在许多情况下，基因型的表达需要两个基因拷贝数的改变。环境中的致突变物可导致一个基因拷贝数遗传改变；或者体内两种独立的事件分别影响两个基因拷贝数的改变，最终导致改变的基因产物的表达。然而抑癌基因p53仅一个拷贝改变就足以使其功能改变。
尽管膀胱癌的发生机制非常复杂，新近研究表明几种肿瘤抑癌基因的相互作用导致细胞周期调控通路的改变，更精确的反映了与膀胱癌发生发展的分子标志。
2.1 RB基因 RB基因位于染色体13q14，编码一种细胞核磷蛋白，正常情况下在G1/S期抑制细胞周期进展。RB基因编码蛋白（PRB）与各种细胞周期调控蛋白相互作用使正常细胞增殖，而这些蛋白功能的改变将导致细胞生长失控。PRb可由细胞周期蛋白催化磷酸化作用诱导而失活，亦可通过Cdk抑制因子（p21WAF/Cip1、p16INK4A、p27Kip1）而灭活Cdk/细胞周期蛋白复合物，从而抑制pRb磷酸化作用[15]。Rb改变的肿瘤与膀胱癌的高分期、分级有联系，且Rb免疫表达缺失与侵袭型膀胱癌病人生存时间缩短有重要联系[16]。
2.2 p53基因 p53基因位于染色体17p13，编码一种重要的与细胞周期调控有关的蛋白[16]。当DNA损伤时，p53蛋白的水平增加，导致细胞周期失控。因此，必须通过DNA修复来阻止有缺陷的DNA的复制。p53基因突变导致生成的异常蛋白比野生型蛋白的寿命延长一半。由于蛋白存活时间的差异，导致p53 突变基因产物在细胞核内累积，可容易地通过免疫组化的方法检测到。
研究发现，与野生型p53表达的患者相比，突变的p53表达与患者肿瘤复发、肿瘤进展、生存时间明显缩短以及恶性程度有关；而且p53和p21表达均阳性的患者其预后最差。除此之外，多变量分析表明p53在核内累积与组织分级、病理分期有重要关系，可作为一项膀胱癌独立的预后因素[15]。因此p53活性增加是肌侵袭型膀胱癌患者的不利因素。目前以p53为靶点、运用腺病毒载体Ad5CMV-p53的基因治疗已成功的进行了1期临床试验[18]。
2.3 RB基因与p53基因 实际上，p53和 RB两者都发生改变的肿瘤比携带正常野生型p53和 RB基因的肿瘤预后差，两者之一发生改变的肿瘤居中。新近研究表明p53和 RB两者表达在膀胱癌的发生发展中起独立协同的作用[19]。
2.4 p21WAF/Cip1 尽管将p53发生突变作为膀胱癌的一个预后因素，但并不是所有p53发生突变的肿瘤都发生复发或继续恶化。实际上，p53介导的细胞周期调控受p21WAF/Cip1表达调控的影响[15]。因此，p53的突变可能导致p21WAF/Cip1表达的丢失，从而导致细胞生长失控。然而，p21WAF/Cip1表达也通过p53通路介导[20]。因此，即使存在p53突变，也能维持细胞周期调控。
p21WAF/Cip1表达的丢失与肿瘤复发和减少生存时间密切相关，且p21WAF/Cip1通过p53通路介导的表达可能影响细胞周期调控，p53发生突变和p21WAF/Cip1表达丢失的肿瘤预后较差，这些病人需要进一步的辅助治疗[15]。
2.5 p27Kip1与cyclin E、D p27Kip1和细胞周期蛋白E（cyclin E）低表达与肿瘤分级、分期和恶化程度有关。cyclin E 阳性表达率在复发肿瘤中随病理分级升高而升高, 但与临床分期无关，p27kip1 阳性表达率随病理分级、临床分期升高及在复发肿瘤中下降。cyclin E 与p27kip1两者的阳性表达有显著相关性，表明cyclin E 和p27kip1 表达可能是判断膀胱癌生物学行为的重要指标[20]。且p27 kip1低表达同时伴随或不伴随cyclin E的低表达与膀胱癌的预后负相关[21] 。 p27Kip1在许多癌症表达量减少，且与cyclin E表达增加有联系，这表明在膀胱癌中存在差异，Juan等 [22]描述了cyclin E在膀胱癌细胞株的核浆核膜处分裂，表明cyclin E核内局部发生改变，而不是过表达，然而，这一假说仍然需要被证实。有趣的是，如同cyclin D1的低表达 ，表浅型膀胱癌p27Kip1的低表达与肿瘤复发和侵袭性相关[23]。Sgambato等[24]研究显示，低cyclin D1、低p27Kip1、高增殖指数的膀胱癌患者其复发的风险较高。其他癌症中，cyclin D1过表达与高增殖和增加复发风险或进展有关。cyclin D1和E在膀胱癌中的表达调控和预后效果仍然需要进一步研究。新近研究发现，p27 kip1的功能丢失可能是TSC1发生突变的一个重要原因 [23]。
3 新血管生成
血管生成是指在外周建立新的脉管系统的过程，需要一个紧密的调控方式参与。肿瘤形成也需要新的血管生成，在多数自我平衡条件下，很少有血管生成，位于血管内皮的大量抑制信号参与调控过程，血管生成处于沉默状态。而在肿瘤微环境下，各种刺激因素和抑制因素之间的平衡状态被打破，内皮细胞诱导新血管生成，为肿瘤的生长和转移提供必要的营养。
目前认为几个机制与肿瘤血管生成有关，包括各种诱导因子的过表达和内皮细胞抑制因子的丢失。肿瘤细胞本身、肿瘤细胞释放到外周血管物质、与肿瘤有关的角膜细胞或者浸润肿瘤物质宿主炎症细胞都参与了新血管的生成[25]。
3.1 微血管密度
目前认为在特定的肿瘤周围的微血管密度可提供预后信息，通过测量凝血因子Ⅷ和CD34抗体可确定新血管生成的程度。Dicknson等 [25]研究发现，微血管密度计数升高与膀胱癌进展、患者生存时间减少和肿瘤复发密切相关，且死亡风险增加2.5倍，表明微血管密度计数是一项膀胱癌独立的预后因素。Offersen等[26]研究表明微血管密度也是一项揭示膀胱癌进展、组织分级、病理分期、淋巴结转移和患者生存时间的独立的预后因素。
3.2. 血管生成诱导因子
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在膀胱癌患者尿液中的含量比非膀胱癌患者高。Bochner等[27]证实尿液中的bFGF水平与肌侵袭型膀胱癌患者的病理分期相关，尿液中血管内皮生长因子（VEGF）的水平比对照组高，且与肿瘤复发相关。
在膀胱癌中可检测到COX-2的表达，并且与局部侵袭、淋巴管粘连以及复发有关，但不是一项独立的预后因素[28]。很明显COX-2在膀胱癌的发生发展过程中起重要作用，且COX-2能够促进pTa/T1期膀胱癌患者的血管生成，但不预测复发[29]。目前，应用COX-2抑制因子治疗膀胱癌以及其他癌症的实验正在开展。
3.3. 血管生成抑制因子
正常的内皮细胞含有高水平的TSP-1，它可抑制bFGF 和VEGF的诱导作用，从而抑制血管生成，后被一种中立的抗体灭活。Jayet等[30]研究发现侵袭型膀胱癌TSP-1的低表达与肿瘤的高复发、生存时间减少有关，有器质性病变的患者这种相关性更加明显，提示TSP-1表达是膀胱癌复发和生存时间减少的一项独立的预后因素，可作为一种新的治疗靶点，而且TSP-1低表达与微血管密度计数有关。
3.4.转 移
肿瘤在远处基质侵袭和生长的能力决定转移。基质和上皮成分之间的复杂相互作用，以及与肿瘤有关的细胞外基质蛋白的降解对肿瘤转移起重要作用。细胞外基质为内皮黏附和毛细血管形成提供了条件，基质中的金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）也与肿瘤的分化密切相关。
研究发现在肌侵袭型TCC患者的血清和尿液中MMP-2和MMP-9水平升高，并与生存时间降低相关，而且MMP-9在膀胱上皮中的表达TCC患者比正常人高，并与肿瘤分期直接相关[31]。CD44是一种广泛表达的细胞表面黏附分子，细胞与细胞、细胞与基质相互作用有关，并通过ras进行信号转导。CD44在表浅型TCC患者中的表达增加，而在侵袭型TCC中表达降低。新近研究表明CD44是膀胱上皮癌的一个预后因素，而且在膀胱上皮癌中突变CD44v6-10/标准CD44的比值与肿瘤的发生发展密切相关[32]。
4.将来指导
人类基因组计划的完成为分子生物学的发展开辟了新的天地，人类对肿瘤的认识也越来越深刻。肿瘤生长、侵袭和扩散的能力受多种因素的影响，一种单一的分子标志物不可能提供对肿瘤生物学行为足够的信息。肿瘤标志物的最终的运用必须通过大量的实验对众多的分子终端进行评价，这一策略可能提供了一个更精确评价肿瘤生物学行为的方法。
目前，传统的组织病理学对膀胱癌的分期分级只是对临床结果作粗糙的分类。虽然从分子生物学的角度对肿瘤的认识取得了重大的进步，但是，基于分子标志物对肿瘤的生物学行为进行精确预测仍然处于研究阶段，我们对染色体异常、细胞周期调控失控、血管生成以及多种潜在的反映膀胱癌预后分子标志物作了综述，最终目的是希望能够选出精确预测肿瘤生物学行为的可靠的标志物，为膀胱肿瘤的早期诊断和早期治疗并最终达到三级预防提供一定的指导作用。
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