朱理珉  王艳荣  梁树人  李顺天  徐  健  天津市传染病医院  300192
    对于乙型肝炎病毒(HBV)感染造成的终末期肝病，目缺乏有效的治疗手段，通常最终采用原位肝移植(OLT)治疗，但是术后乙型肝炎病毒再感染严重影响患者的长期生存。在没有采取任何防治措施的情况下，移植后HBV再感染率高达上80％以上。乙型肝炎复发后可在短期内发展为肝硬化、肝功能衰竭，成为乙肝患者移植术后首位的死亡原因。多克隆乙肝免疫球蛋白(HBIg)的使用可以显著降低肝移植后乙肝病毒(HBV)再感染率，有效率为50％-90％。既往多项研究指出单克隆或多克隆HBIg治疗后HBV再感染者出现HBV S基因变异，研究者认为HBIg的产生的免疫压力，导致出现S基因变异病毒或将变异病毒选择出来，而该变异病毒能够逃逸抗体的中和作用。我们以巢式PCR与序列分析的方法研究肝植患者术前、术后HBV S基因的序列改，进一步阐明HBIg对HBVS基因变异的影响。
    材料与方法
    1．病例
    因HBV感染终末期肝病于天津市第一中心医院行肝移植治疗的7例患者，见表1。
    表1  7例肝移植患者
    术前乙肝移标志物    犬后
  编号     性别/年龄——HBsAg    HBeAg    HBeAb    HBcAb    HBeAb-IgM——再感染时间
  A1        男／39        +                          +                      2月
  A2        男／33        +                          +                      4月
  A3        男／50        +                          +                      12月
  A4        男／4s        +                          +                      10月
  B1        男／37        +        +                 +                      1月
  B2        男／43        +                          +                      3月
    7例患者分为A、B两组：
    A组(A1-4)为术后使用HBIg治疗并发生HBV再感染者；
    B组(B1-3)为术后未用HBIg治疗出现HBV再感染的患者。
    术后HBV再感染定义：血清中HBsAg再现。
    患者术后常规给予强的松龙、环胞素A、硫唑嘌呤或FK506免疫抑制治疗。
    A组患者加用HBIg。    
    2．实验材料
    2．1  标本
    术前采血、术后定期采血至再感染为止。采血后立即离心取血清，—70cC冰冻保存，以术前及复发后的第一次血为标本。
    2．2试剂
    引物合成于上海生工生物工程公司。Rnase、EcoRI、T—easy载体购自Promega产品。Taq酶等试刘购于北京鼎国生物技术发展中心。测序试剂盒购自加拿大Visible Genetics公司。HBV Markers：华美生物工程公司。JMl05为北京人民医院肝炎所提供。
    3．实验方法
    3．1  ELISA检测HBV六项血清学标志：HBsAg、HBeAg、抗—HBs、抗—HBe、抗—HBC、抗—HBclgM。
    3．2  HBV DNA模板制备：50uI血清中加入150ul裂解液(5mM／L EDTA(pH8．0)；10mM／LTris·HCl
(pH8．0)；0．5％SDS；200ug／ml蛋白酶K)，混匀后55摄氏度2小时，冷却后加人Tris饱和酚、氯仿、异戊醇(酚／氯仿／异戊醇体积比25：24"1)200ul混匀后室温放置10-20分钟。提取上清加入400ul(2倍体积)无水乙
醇，1u1糖原，—70摄氏度沉淀1小时。14000rpm离心15分钟后，用真空泵及去上清，真空干燥器抽滤15分钟，
将沉淀溶于lOul三蒸水中，混匀后室温放置10-20分钟。
    3．3  套式PCR扩增HBVDNA及产物检测：自行设计S区引物，外引物1#att ttc gtg gct cc(nt 49~68)，2#act ttc caa tca ata ggc c(nt984~966)，扩增片段为936bp；内引物3#cgc tgg atg tgt cgt cgg cg(nt369—388)，4#ttc caa tta cat atc cca tga agt taa ggg a(nt893—863)，扩增片段为525bp。
    第—次PCR：在DNA模板液中加入PCR反应液，轻弹混匀，石蜡油封。50ul,dNTP1uL(终浓度200uM／1)，Taq酶2U，外引物(1#、2#)各25pmol。PCR反应过程：94摄氏度4min，94摄氏度C40'’-55℃30'’-72摄氏度60'’
(35个循环)，72摄氏度延伸5min。产物经6％聚丙烯酰胺凝胶或1．0％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后，紫外灯下观察结果。扩增产物电泳阴性者，进行套式扩增。套式PCR：取5ul第一次扩增产物加人第二次PCR反应液(引物3#、4#各25pmol，其余各成分同前)混匀，反应条件相同，扩增35个循环。检测方法同前。
    3．4  PCR产物的克隆：剩余PCR阳性产物，经0，8％琼脂糖电泳后，紫外灯下将目的片段切下，包裹于洁净的Parafilm膜中，—70摄氏度冰箱放置30min以上(一般1小时)。挤出凝胶中液体，回收至1．5ml离心管中，加入等体积酚／氯仿／异戊醇(体积比25／24／1)，12000rpm离心15min，弃上清，70％乙醇先2次，弃上清。在空气中干燥后溶于10ul三蒸水中。根据T—easy载体说明行连接反应，转化及提取质粒DNA操作参考文献。质粒DNA经EcoRI酶切鉴定。    
    3．5  序列分析：用Open Gene自动序列分析仪以Sanger双脱氧链末端终止法进行测序：PGR产物4．0摄氏度8．0uL加入Cy5．5标记的引物2．5ul(M13正向引物5’gta aaa cga cgg caa gt 3’或逆向测序引物5# 5’
aag gga gta gcc cca acg tt3’nt870—851，测序缓冲液2．5ul，分别加入预先已加入3ul d／ddATP、d／ddCTP、d／ddGTP、d／ddTTP混合液的PCR反应管中，液体石蜡封顶，进行PCR[94℃变性4分钟；94℃30'’—57℃50'’—72摄氏度60''(35个循环)；72摄氏度延伸5分钟)循环后止反应。标本加入测序胶电泳，计算机自动读取序列。结果与GenBank中发表的序列进行比较。
    结  果
    7名患者HBsAg、HBeAg抗—HBc阳性者1名，余均为HBsAg、抗—HBc阳性，具体结果见表1。
    S基因的直接测定结果见图1(nt 514-633)。选择术前和／或术后a决定簇内存在变异的标本进行克隆后测序(A4术后标本未做克隆)，各点变异频率见表2。(A4因术后采血晚，未能做克隆，只做直接测序)。
    (1)术前变异已存在于患者体内，在术后随访过程中，变异株逐渐成为患者体内的主要病毒株或者完全
发展变异病毒感染。例如：Tiel26Ser(A1)、Thrl31Asn(A1)、Serl43Thr(A2)术前均为变异株、野生株混合
感染，以变异株为主，术后转变为完全变异株感染；Metl33Thr(A1)、Glyl45Ala(A4)变异病毒术前已经成为
患者体内唯一的病毒标；而在B2中术前以aal28Ala野毒株为主，术后则以aal28Val变异株为主。
    (2)术前作为劣热病毒株的变异病毒持续至术后，仍为少数病毒株，如Glnl29终止子(B1)、Serl54(B1)、
Serl36Cys(B2)。
    (3)术前没有变异病毒，术后出现某些位点突变。患者B2aal38Cys术后变Arg，而趴术前为aal40Thr
病毒株单纯感染，术后出现aal40Lys与aal40Thr混合感染，但以野生株为主。
    表2  术前、术后各点变异频率(aal22-160)
    
    讨  论
    乙肝病毒为逆转录病毒，其聚合酶缺乏自我校对功能，因此HBV变异率较高。慢性乙肝病毒感染者体内自然发生的乙肝病毒变率约为1．4—3．2X-500000／nt·年，而肝移植患者(HBIg治疗者)的变异率比前者高100倍。HBIg造成的免疫压力对乙肝病毒表面基因变具有促进和选择作用。美国Ghany等观察20例术后HBV再感染患者发现a决定簇出现突变的频率与HBIg疗程相关，应用HBIg治疗6个月以上者a我突变频率明显高于疗程在6个月以下者，且停用HBIg后部分变异病毒可以恢复为野毒株，说明变异株出现与HBIg的使用有磁。某些变异病毒编码的表面抗原(HBsAg)不能被抗体识别，即使患者体内存在高滴度的抗—HBs，变异病毒仍能长期生存，而引起移植肝感染，故称为“抗体逃逸病毒”。
    在本实验中，A组患者(使用HBIg治疗)术前存在变异株和野生株混合感染(aal26、aal31、aal43变异病毒)，但术后几乎全部发展为单纯变异病毒感染。尤其患者A1术后仅2个月即出现HBV再感染，在很短的时间内野生型病毒就全部被清除。而B组患者(未用HBIg)HBIg术前的混合感染，一直持续至术后，并长期稳定存在。唯一可能的解释是HBIg的免疫选择作用在短期内快速结合并清除了A组患者占少数的野生型病毒，使变异株成为患者术后唯一的病毒株。而B组的变异病毒由于没有HBIg选择压力，因此术后仍处于野毒株、变异株混合感染的状态。如果B组患者同样给予HBIg治疗，很有可能在术后发展为单纯变异病毒感染的模式。术后HBIg治疗4个月，患者A2的aal38位点由Cys全部转变为Arg，说明HBIg具有促进变异的作用。
   有人认为HBIg与HBsAg的结合本身并无清除病毒作用，它只是控制了病毒在肝脏内的横向扩展，同时将病毒复合控制在一个很低的水平上，只有长期使用HBIg治疗的患者，才可延长HBV再感染的时间。但是病毒变异使HBIg识别及结合表面蛋白的能力明显减低，往往造成免疫预防失败。研究指出，术前已经存在的变异病毒可以持续复制而引起第二次、第三次肝移植失败，而对于这些患者给予HBIg免疫预防交不适宜。
    HBV S基因变异命名临床预防肝移植后乙肝病毒再感染的工作更为困难，如何对这些存在变异病毒的
患者进行免疫预防和治疗，还有待于在今后的工作中进一步摸索和探讨。

相关文章

电化学发光免疫法定量检测乙肝病毒的临床应用.. 标本溶血对ELISA检测乙肝表面抗原的影响.. 乙肝患者重叠感染CMV的观察 HBV血清标志物与乙肝病毒前S1抗原检测结.. 乙肝病毒感染与原发性肝癌及甲胎蛋白的关系(..

热门文章

临床乙肝五项检测结果及其分析 孕妇ABO血型抗体效价936例的检测及分析.. 细菌耐药机制的现代概念 临检专业的现状,发展和对策 肿瘤标志物临床应用研究现状