我想进展方面有三个，一个是各种自动化检则仪器的升级和使用;一个是检测标准化的问题:再一个是一些新的检测项目陆续进入临床应用。
差距,我和各位主任的想法恐怕是一致的,主要不在技术和仪器本身上,而在工作的管理,特别是操作规范化、标准化、质量保证体系的运行和与临床的沟通上。
一、自动化检测仪器使临床检验工作面貌一新,但也带来新的问题
这些年来,血球自动化计数仪,尿液分析仪,凝血仪,血沉仪以及各种快速,便捷的试剂条,试验卡广泛地应用在门诊、病房和急诊的常规检验工作中,不仅大大地提高了工作效率,缩短了检验时间,方便了病人,也减轻了操作人员的劳动强度,使临检工作面貌一新。但是,也带来新的问题。有的工作人员过分地依赖仪器报告的数据,忽视了显微镜检查,造成漏诊和误诊,特别是急性白血病、血小板疾病的漏诊和误诊率较高。尿液检查自使用尿分析仪以后,本应当加强对检测报告的分析把关,必要时一定要进行显微镜检查,并以显微镜检查为准,但是,执行得不认真,也给临床和病人带来许多问题。
我们必须清楚,仪器分析的方法学和我们传统的显微镜检查有根本的区别,两者目前还有一个很好的对应关系。
比如,血球分析仪从简单的两分类,三分类,到现在的五分类仪器,使用得越来越多。当然,五分类仪器由于采用除电阻抗原理外,还吸收了电导,光散射原理,形成所谓的VCS技术;甚至有的仪器还应用了射频技术,细胞化学染色技术,多角度偏振光散射技术。在仪器功能方面,许多仪器都使用了计数周期的控制技术，样品进样和防堵孔技术;为了保证血细胞计数的准确性,特别是血小板计数的准确性,许多仪器采用了计数周期的控制技术,样品进样和防堵孔技术;为了保证血细胞计数的准确性,特别是血小板计数的准确性,许多仪器采用了扫流技术,鞘流技术，防返流装置Von Behrens感应器,延迟计数,浮动界标和拟合曲线等措施。但是,不论生产厂家采取什么样的技术和措施,仪器如何升级换代,都代替不了人工显微下对细胞形态的真实观察。此外,越是高档次的仪器对标本的要求也就越苛刻。
Sysmex SF-3000是一台五分类的高档血球分析仪,它通过分类(DIFF)和白细胞/嗜碱性粒细胞(WBC/BASO)2个测试通道,采用流式细胞仪原理和半导体激光技术进行白细胞分类的,但是仪器仍然有三种提示旗号:（1）Imm Gran(未成熟粒细胞);(2)NRBC/PLTC(有核红细胞/血小板凝集);(3)Blast/Aty(原始细胞/异常淋巴细胞)。天津市等三中心医院检验科的高洁,许宏敏,卢普美同志、总结了182例仪器检查有异常提示病例,结果是该仪器对异常细胞检出的特异性为72.2%,敏感性为98.2%,检出有效率为80.2%。具体可见表1,2。
为什么仪器的假阳性率如此高,分析其原因有二:一是仪器设置的警示阀较低,为的是提高仪器的灵敏度,以减少漏诊;二是与工作条件有关,仪器负荷重,稳定性减低,可使警示阀改变。
即使是目前最先进的Sysmex HST-300全自动血液分析工作站,它是由主机SE-9000,R-3500和SP-100组成,分别采用了电阻、射频和流式细胞仪等技术,不仅可以对白细胞进行五分类,还可以计数网织红细胞以及自动推片、染色。但是仍然有自动报警设计,通过IMI(未成熟细胞)来识别幼稚细胞,提高仪器对异常细胞的检出率,也不能完全取代显微镜检查。
更何况,仪器越先进、高级,对试验条件的要求也就越高,你稍不注意,报警装置就会经常给你发出各种警示旗号,弄得你不知道要不要进行人工复查。
因此,做为检验科主任必须要求我们的具体操作者,严格按照规范化操作程序进行,这些程序必须文件化,写入实验室操作手册,每个人都必须严格执行。
又如,尿液分析从尿8项分析仪,发展到尿10项分析仪,为了控制维生素C对尿糖、尿蛋白等检测的干扰,又推出了尿11项分析仪,这些仪器大家都已经很熟悉了。但是,尿液的干化学检查仅是尿液检查的过筛试验,并不能做为泌尿系统疾病的诊断试验。
尿沉渣检查对临床诊断泌尿系统疾病很重要,但操作起来很麻烦,又不规范,所以,尿沉分析仪也研制开发出来并已经推向市场。美国DiaSys R/S2003尿沉渣定量分析工作站和日本Syemex UF-100尿沉查分析仪就是其代表,国内一些生产厂家也在推出自己国产的尿沉渣分析仪,看来,大有普及的趋势。上述两种尿沉渣分析仪的原理不同,各有优点。
例如Syemex UF+100尿沉渣分析仪采用了流式细胞仪和电阻抗原理,根据尿液中不同有形成分的荧光强度,前向角散射光强度和细胞通过产生的电阻抗分别落在不同的区域,打印出红细胞,白细胞的直方图和各有形成分的散点图。DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站则完全依靠光学显微镜的对有形成分的形态观察,不仅可将有形成分具体地显示在显示器的荧屏上供操作人员分析,而且可以通过一个固定的流动计数室对细胞等有形成分进行定量计数。虽然,这两种尿沉渣分析仪原理不同,但都克服了操作者主观性造成的误差,提高了检测的精密度和准确度,并使尿沉渣检查规范化和标准化。但是,是不是有了尿沉渣分析仪,我们就可以完全依靠它,而放弃显微镜检查呢?显然不能这样。更何况,仪器不能对白细胞进行分类计数,而尿液中白细胞的分类检查对临床诊断感染性疾病和免疫性疾病是非常关键的。况且,在这些尿沉渣分析仪没有普及情况下,目前我们大多数医院的人工尿沉渣检查现状如何?恐怕主任们心中有数。
粪便检查的现状也不令人满意,首先我们国家临床医生对粪便检查的目的性不明确,好象不是很有目的,而是一种常规,有病必查粪便。有人报告,国外住院病人检查粪便的不足10%,而我们医院可能高达70%以上。大量无意义的劳动占去我们病房检验人员的时间,又如何能把注意力集中在有问题的标本上呢?就我们自身来讲,我们又有多少人能准确识别粪便中不同的寄生虫卵?肠道传染病发病率始终居高不下,除了痢疾杆菌之外,出血性大肠杆菌O157:H7,成为新的致病菌,危害很大;抗生素的大量和不适当的使用,肠道菌群失调性腹泻发生率逐年增加;由于艾滋病的蔓延,隐孢子虫感染也成为一个重要的临床问题,这些都对我们粪便微生物的快速检查,快速诊断提出的新的要求,当然不仅是快速,更应当强调准确。
再如,各种半自动,全自动凝血仪基本上已经完全取代了手工操作,PT试剂也有了ISI值,是不是凝血检查就不存在问题了?我举个例子,大家都知道,报告病人PT和APTT结果时,一定要同时报告正常对照的PT和APTT测定值,以便让临床医生判断患者的PT和APTT的参考范围固定编进仪器的计算机系统,正常对照不用做了,正常对照不是一个具体数字,而是一个范围,这符合要求吗?还有,试剂的ISI在你这个仪器上,有没有改变,按照试剂的ISI值,计算不同仪器的INR有没有差异?如果有差异,对临床口服华法令的监测有何影响?如何解决?
此外,计算机图象识别能力软件的开发和应用也给我们传统的显微镜检查带来新鲜的内容,比如现在市场上正在宣传的多功能显微图象分析系统,除了可以对骨髓细胞进行形态学分析,还可以对染色体,精子进行分析,当然这些分析都是计算机模拟进行的,准确度多在90%左右,但对疑难病例和不典型的形态学变化,仍需要人工检查。又如,根据细胞核仁区非组蛋白硝酸银染色原理建立的KL-型肿瘤免疫图象分析系统以及根据荧光染色和激光照射的原理设计的网织红细胞自动分析仪等。虽然这些技术本身是建立在显微镜检查的客观基础上,但是仍然存在操作规范化或标准化的问题,不同的软件对细胞分析判断上也有不同,如何做到一致和标准化?
血液流变学检测义器目前市场上比较混适,各个生产厂家都在竭力宣传自己的产品,但是国家尚没有统一的行业标准,只有企业标准,临床应用中缺乏规范化操作程序,又没有符合要求的质控物,仪器不能定期进行校准,所有这些问题都使得血液流变学参数的临床意义大打折扣,很难得到临床医生的认同。
二、检测过程的规范化和标准化已成为我们面临的最紧迫的问题
规范化和标准化的含义是不同的,规范化是指某项工作的一致性或称统一性,大家都按这个程序或步骤去做相同一件工作,大家的工作就有了可比性;标准化是指制定一个条件,一个程序,它首先要达到满足质量要求并可溯源到国际或国内最高标准的,大家都应遵守的一套工作程序。可以说,实现标准化就实现了规范化,但规范化的东西不一定都符合标准化的问题。
(一)血细胞计数的规范化
1.规范化
(1)采血的部位,抗凝剂的使用,容器的选择,标本的保存,标本的稀释:
这里我只提一下测定时间对质量的影响。
EDTA抗凝的末梢血应至少在15分钟以后进行测定,因为在这段时间内有些标本血小板有暂时的聚集现象,使血小板计数假性减少,这不仅影响血小板其他指标的准确性,也造成红细胞计数有所增高。取血后立即检测,标本的血小板和白细胞体积分布直方图可能是异常的,放置一段时间后在测定就可得到分布正常的直方图。
(2)试剂的配套使用,特别是溶血剂的正确选择和使用:
全自动血液分析仪可以控制溶血剂的加入量及溶血剂作用时间。但在使用半自动血细胞计数已进行血细胞计数时,需要在血液予稀释后人工加入溶血剂,溶血后在进行血细胞计数和分类计数,正确掌握溶血剂用量及溶血时间非常重要。如果加入量不足或加入后放置时间过短,可以造成溶血不完全,使未溶解的红细胞计如白细胞中,造成白细胞假性增加。溶血不完全也可以使血红蛋白测定偏低。如果加入溶血计量过多或放置时间太久白细胞明显变形,使白细胞直方图异常,白细胞分类计数结果不准确,甚至不能进行分类计数。
(3)标本自身的干扰因素:
其中血小板计数最容易受干扰,大家都很清楚,血小板计数的范围(又称计数阈)是2-24fl,3-20fl为准确计数阈,20-24fl为血小板计数的漂浮阈。小红细胞体积<24fl,计入血小板,使血小板假性增高;巨大血小极和血小板聚集,计入红细胞,使血小板计数假性减低。
(4)工作环境的监测。
(5)新仪器或新监测系统的性能评价。
(6)仪器的校准。
仪器使用一段时间后,必须进行校准。校准前应彻底清洗管道,去除管道中的残留血液,吸附的蛋白和纤维等,然后测定试剂空白,本底符合要求(一般要求红细胞、白细胞,血小板和血红蛋白四项本底为0)。要检查标准物是否在有效期内,外观有无变化。从冰箱取出后,要平衡至室温,轻轻混匀。在仪器上测定标准物11次,第1次数据不用,从第2次到11次,计算均值,标准差,绝对误差和相对误差。判断标准结果,必须达到标准要求。见表3。
如果各参数的绝对误差和相对物产小于一级要求,属合格,不须做任何校准;如果参数大于一级要求,而不小于二级要求,可按仪器说明书要求调整系数。调整后应再测定另一瓶全血校准物,应当达到一级要求。如果结果大于二级要求,则需通知厂家修理和调整,此时仪器应停止使用。
(7)室内质控制措施;
(8)室间质评的评估和分析;
(9)纠正措施和实施记录;
(10)人工显微镜复查的规定。
2.人工显微镜复查的规定
中华医学检验学会1995年在武夷山会议上曾就在使用自动化血球计数仪当中进行必要的人工显微镜复查提出过一个标准,其中规定凡出现以下情况之一者,都应当进行显微镜复查:
(A)血细胞计数结果明显异常；
(B)血细胞直方图异常;
(C)出现警示旗号。
可是我们很多具体操作人员在日常工作中并没有严格执行,而是想起来就做,想不起来就不做;有的异常就做,有的异常就不做,各有各的"标准",这种情况必须加以纠正,统一到规范化规定上来。
(1)有人问,血细胞计数明显异常如何掌握?
可以从两个方面掌握,一个是试验允许误差,一个是医学决定性水平。
(2)有人问直方图异常如何掌握?
A.红细胞直方图比较容易掌握,峰值左移--观察血涂片,是否红细胞体积偏小(再结合MCH,可分析是否有色素含量减少);峰值左移--观察血涂片,是否红细胞体积偏大(再结合MCH,可分析是否有色素含量增多);双峰时,也要观察血涂片,注意红细胞的特点。
B.白细胞直方图也不难掌握,正常情况下三分类血球分析仪打出的是"两峰一谷":第一个峰,细胞体积范围是35-98fl,代表占外周白细胞总数20-40%的成熟淋巴细胞;第二个峰,细胞体积范围是150-450fl,代表占外周血臼细胞总数50-75%的嗜中性粒细胞;细胞体积范围98-150fl,代表占外周血白细胞,嗜酸和嗜碱性粒细胞,因三者之和,也仅占外周血白细胞总数的10%左右,相对于成熟淋巴细胞和嗜中性粒细胞来说,比例很小,所在直方图上只能是个"谷"。如果白细胞直方图失态,不是"两峰一谷",而是单独的一个峰,而这个峰有恰恰位于原来的"谷"的位置上,那是急性非淋巴细胞性白血病的重要特征。如果这个单峰基本位于原来淋巴细胞的位置上,那是急性淋巴细胞性白血病的特征。如果正常的淋巴细胞峰变得很矮小,而原来嗜中性粒细胞变得又宽又高大,那是慢性粒细胞性白血病的特征。这些只要我们做血涂片观察，我想任何一位检验工作者都不会漏诊白血病。
C.血小板直方图的异常比较难掌握,因为血小板直方图的改变往往是干扰造成的，常见的干扰有小红细胞,细胞碎片,微小的血凝块,血小板聚集等。
如小红细胞增多时,如严重的缺铁性贫血,这些体积小子20fl的小红细胞就可能进入血小板的计数范围之中,使血小板计数假性增高。同时，血小板直方图出现尾部曲线上升的形态。
如细胞碎片,如果碎片大于红细胞体积界限的低值时,这些碎片会被计数为红细胞使红细胞计数假性增高,不会对血小板直方图产生影响。但如果细胞碎片小于20fl,将被计数为血小板,使血小板计数假性增高。同时,使血小板直方图前部曲线抬高。
如血小板凝块,少量小的凝块不会对血小板直方图有明显影响。大的血小板凝块,体积大于20fl,将被计数为血小板,使血小板计数假性增高。同时,使血小板直方图前部曲线抬高。
如血小板凝块,少量小的凝块不会对血小板直方图有明显影响。大的血小板凝块,体积大于20fl,不仅使血小板计数减少,即假性减低;而且使血小板直方图尾部升高(类似于小红细胞对血小板直方图的干扰)。
如红细胞凝块,由于体积较大,不仅可以计数到红细胞数中,使红细胞计数假性增高，而且使血小板直方图整个曲线水平抬高,成为一条类似水平的曲线。
五分类血球分析仪由于采用的多种技术,它们显示的不是细胞体积的直方图,而是三维状态的散点图。正常的血细胞在散点图上有其固定的位置和形态,如果散点图异常,也同样提示有异常细胞出现,同样应当进行血涂片检查。我前面已经说过,不论生产厂家采取什么样的技术和措施,仪器如何升级换代,都代替不了人工显微镜下对细胞形态的真实观察。
(二)尿沉渣检查的标准化
1.尿沉渣检查的指征:
美国临床检验标准委员会(NCCLS)规定凡有下述情况的应进行显微镜检验:
(A)医生提出镜检要求的;
(B)检验科规定的患者(如泌尿科、肾病科、糖尿病，应用免疫抑制剂及妊娠妇女)
(C)任何一项理化检验结果异常的。
我国检验学会规定凡红细胞,白细胞,蛋白和亚硝酸盐四项干化学检查中有其中任何一项不正常者都应进行显微镜检查，并以显微镜检查报告为准。
那也就是说,只有干化学法检测尿液红细胸,白细胞,蛋白和亚硝酸盐四项检查均阴性(正常)时,检验人员可不做显微镜检查(复查)。
2.尿沉渣检查的标准化:
尿沉渣显微镜检查是尿液分析中的重要组成成分,其在泌尿系统疾病中的诊断价值已被临床医生所肯定。但是,长期以来,因尿沉渣成分复杂,检查难度大,又缺乏标准化和有效的质量控制措施,使得这项检查对临床诊断的意义大打折扣。
1995年NCCLS,JCCLS以及1997年欧洲尿分析协作组都先后制定文件,规范尿沉渣的检查方法。这些文件虽然具体内容上略有不同,但都强调:
(1)检测尿液要新鲜,要使用带刻度,尖底离心管;
(2)尿标本必须定量,按标准化要求定时,定速离心沉淀,留置离心尿要一致;
(3)尿沉渣必须定量检测,经显微镜下确证;
(4)用专用术语和单位体积定量报告结果。
1997年第二版《全国临床检验操作规程》中是这样规定的:
(1)标本采集:晨尿,1小时内送检;
(2)标本处理:10ml,加入带刻度的离心管(没有具体规定非是尖底不可,但最好用尖底管);500g,离心5分钟,留取尿沉渣0.2ml;
(3)样品制作:0.2ml尿沉渣滴在干燥清洁的玻片上,加盖18mm×18mm的盖玻片;
(4)检查方法:湿片法,不染色,普通光镜,计数细胞要观察10个高倍视野,计数管型要观察20个低倍视野;
(5)结果报告:细胞以每高倍视野最低-最高数,管型以每低倍视野平均数。
标准化之中非常重要的就是定量报告的方式。
3.尿沉渣板定量分析:
A.器材
(a)尿沉渣离心管:带有刻度,可放10ml尿液,管底有一个"凸凸头"。当倾倒离心后的上清尿液时,"凸凸头"里的尿沉渣不会流出,大约容量为10ml。
(b)尿沉渣定量分析板:每块分析板上有10个均一厚度(0.1mm)计数池,每个计数池内有固定体积(1μl)的计数区(十数区内划分10个中方格,每个中方格又划分为9个小方格)。
B.操作
(a)取均匀混合尿10ml于离心管中,1500r/min,离心5min,倒去上清尿液。
(b)取1小滴(15-20μl)尿沉渣冲入定量分析极其中一个计数池中,然后用低倍镜观察,高倍镜计数,计数在1μl计数区内红细胞,白细胞,上皮细胞和各类管型的数量。
C.参考值范围
非常不统一。
传统的尿沉渣检查是放大400倍,观察10个视野,如果每离倍镜视野红细胞超过3个,为镜下血尿,臼细胞超过5个为白细胞尿。
使用尿沉渣检查,一般红细胞少于8个/μl,但也有报告正常参考范围是<5个/μl,儿童少于14/μl;白细胞<10/μl。
对于尿沉渣的检查,建仪使用定量板法报告,而尽量不使用载玻片报告法,见表4。
从上表也可以看出,定量板法检查的重复性明显优于载玻片法。
4.尿沉渣定量分析仪
UF-100尿沉渣分析仪是按照血球计数仪的计数原理进行尿液中细胞计数的,而DiaSysR/S2003尿沉渣定量分析工作站是根据流动计数池计数的,它们的计数方法不同,到底两者结果相关性如何,还缺乏大规模,多中心的研究。
301医院丛玉隆等人对400例正常人的尿液标本分别用四种方法进行定量计数,我用表5的形式归纳如下:
镇江医学院顾可梁等人用UF-100尿沉渣分析仪对83例健康人进行了检查,报告参考范围是:红细胞,男性0-12/μl,女性0-19/μl;白细胞,男性O-11/μl,女性0-32/μl发现男,女之间有明显不同。
上述两个调查值表明使用UF-100尿沉渣分析仪检测的结果要比传统离心法显微镜尿沉渣板检查的结果要高。
在不能普及尿沉渣自动分析仪的情况下,我国应当尽快统一规定,采用尿沉渣板进行定量报告为标准方法并确定参考值范围。
(三)常规凝血相检查
1.规范化:
(1)抗凝剂的使用,标本的采集,处理。
ICSHT和ICTH推荐使用109mmol/L的拘橼酸钠为抗凝剂。
大多数凝血实验须用第二管血液进行检测,这是因为第一管血可能混入组织液,其中含有组织凝血活酶可启动凝血过程,使检测结果发生改变。
标本采集后,上下颠倒采血管8次,以保证血液和抗凝剂充分混合,但不能剧烈震荡。
对不合格标本,如有凝块,一定要退回重新取血,如果血液与抗凝剂比例不对(真空采血管事先已经加好抗凝剂,应取够血量)也应重新去取血,如果严重溶血,黄疸和乳糜血如能退回重新取血最好,如不能退回,则应在报告结果时加以注明,其检测结果可能受干扰而不准确。
取血后尽快将标本送到实验室,在取血60分钟内分离血浆。分离后的血浆应在4小时内检测完毕。如果不能当时检测，应置与-20℃或-70℃保存。
在1000g以上,一般采用3000r/min的离心速度离心10分钟分离乏血小板血浆。
在测定因子V和因子Ⅷ时,使用冷冻离心机在4℃条件下分离血浆较好;
使用一步法测定Ⅷ:C时要求在15℃条件下,离心速度在2500g以上,离心时间15分钟。Ⅷ:C在取血2小时后不能测定,应在-70℃条件下保存。
(2)仪器性能的评价,校准和试剂
评价内容包括精密度(含正常和异常水平病人标本或冻干血浆的测定;批内精密度要求在3%以下,批间精密度要求在4%以下,日间精密度在5%以下),线性范围,可比性(可根据美国NCCLS颁布的EP9文件的要求进行评价),抗干扰试验(可根据美国NCC颁布的EP7文件的要求进行评价)等内容,在仪器评价的过程中既能使操作人员熟悉操作方法,又能验证测定方法的正确性。
新仪器在测定常规标本前要建立标准曲线,在更换试剂批号或仪器维修后等情况下应重新建立标准曲线。无法定标的测定项目如APTT,可使用配套的校准物进行校准。使用半自动仪器的实验室要特别注意加样器的校准。试剂使用建议使用仪器生产厂有推荐使用的配套试剂。仪器与配套试剂,配套的校准物,质控物和一定的操作方法组成了一个质量体系,校准物和质控物的定值以及仪器各种性能指标的制定都是在这个系统下完成的,如果使用非配套的试剂,即使使用校准物校准仪器后也可能出现临床无法解释的测定结果。
(3)室内质控和室间质量
通过开展室间质评活动可以改善和提高实验室测定结果的可比性。用偏差为指标对各实验室测定结果进行评价,目前使用的评价标准是PI15%,APTT15%,Fbg20%。
(4)参考值范围的确定
正常值不是操作规程或教科书上订出的简单固定的范围,而是随着仪器、试剂、年龄、性别以及测定环境等因素而变化的,因此各实验室应根据自己的实际情况确定本实验室的正常参考范围。在选择正常人群时应考虑到年龄、性别的问题。选择25-60岁男女健康人各10例,这些健康人要救无高血压,糖尿病肝脏及肾脏疾病,无出血性疾病和血栓性疾病病史和家族史。分别检测其PT和APTT时间,取均值确定为本实验室正常参考值。
举例:PT标准曲线的建立
方法一:将厂商提供的标准品,按不同活动度设计,仪器自动稀释,进行检测,确定不同活动度相应的时间(秒)建立标准曲线。(具体做法参见仪器有关说明)
方法二:可将20例正常人血浆混合,认定为标准品,设定其PT活动度为100%,然后按"方法一"进行操作。
(5)测定过程中应注意的问题
A.实验条件要保持在37士0.5℃范围内;
B.每份标本要进行双份测定,取平均值;
C.严格按仪器操作规程进行操作,使用半自动凝血仪器在操作时尤其要注意固定预温时间,预温浓度,搅拌时间和加样角度(沿试管壁缓慢加入,但加样头又不能碰试管壁以免改变试管的位置)。只有保持操作的一致性,才能使结果一致。否则一个人操作,结果各异。
(6)仪器ISI值的重新标定(Local ISI)
WHO推荐的凝血活酶ISI标定是用手工法进行的,如果使用仪器法测定PT,试剂标定的ISI值并不代表仪器检测时真正的ISI值。研究表明,手工法标定的凝血活酶的ISI值不适合用PT的自动化检测报告INR值;不同型号的凝血仪对同一种凝血活酶的ISI值影响也有差别。为了保证仪器报告的INR值在不同实验室间有可比性,须用校正后系统独立的ISI值计算INR值,以克服仪器自身的误差对INR检测系统带来的干扰,因此,主张每个实验室在应用仪器检测PT时都应重新标定自己仪器的ISI值。
A.仪器:所用仪器;
B.试剂:不同公司有自己标定的ISI值;
C.血浆:参比血浆,正常人血浆,口服抗凝剂患者的血浆;
D.标本采集:抽取静脉血4.5ml,注入有0.5ml枸橼酸钠抗凝剂的塑料试管中,2500g离心10分钟,分离血浆,PT试验4小时内完成;
E.用WHO推荐的用已知ISI的凝血活酶标定未知ISI的凝血活酶的方法,将仪器测定PT时所用的凝血活酶视为ISI未知的凝血活酶,测定其ISI值并与厂家提供的ISI值进行比较。实验在10天内完成。每天操作步骤为:分别用不同方法(手工挑丝法和仪器法)检测8个标本的PT时间,标本的顺序是2个参比血浆→1个正常人血浆→6个口服抗凝剂患者的血浆→1个正常人血浆。分别计算每种凝血活酶个检测方法的PTR,求出其对数值(logPTR),计算用仪器测定时个凝血活酶的ISI值;
F仪器检测时凝血活酶的ISI值:用仪器检测logPT对手工检测同一标本的logP-TR进行描点。通过线性回归,求得其斜率a,计算仪器测定时的凝血活酶ISI值,计算公式:
例如,郑均等报告,他们使用日本Sysmex公司生产的自动凝血仪CA530和CA1500,并使用美国Dade Behring公司生产的凝血活酶试剂,其ISI值为1.27,进行了仪器自身ISI值的重新标定,结果CA530的ISI值为 1.18,CA1500的ISI值为1.21。而且两种仪器检测同一批标本的PTR值也有一定的差异,并有统计学意义(CA530法对手工法PTR对数值是1.64±1.07vs1.72±1.11,P<0.05;CA1500法对手工法PTR对数值是1.59+1.04vs1.72士1.11,P<0.05;CA530法对CA1500法PTR对数值是1.59+1.04vs1.64±1.07,P<0.05)。而且作者还对两仪器重新标定前后INR值的重复性记住进行分析,结果标定前的变异系数高(13.4%),而标定后的变异系数低(4.8%)。
(引自郑均,黄宇烽,随桂美。《自动凝血仪凝血活酶国际敏感指数的标定》,临床检验杂志,2000,18:23-24)
(7)实验室内质控
A.质控物分定值和非定值两种(前者价格昂贵,后者较低廉);
B.定值质控物又分正常质控物和异常控物;非定值质控物分低、中、高三个质控物;
C.正常质控物用于监测一般患者的检测过程,异常和中高值质控物由于是乏因子血浆,故主要用于抗凝剂治疗过程中的检测:
D.质控物可每日或不定期地与日常标本一起进行检测,以评价仪器的精密度(重复性);
(四)纤维蛋白原(Fib)定量测定
纤维蛋白原(Fib)定量测定是临床上广泛使用的一项试验,文献报告和正在临床应用的方法很多,各种方法都有一定的长处和不足。冯·克劳斯法(Von Cluass法)属于功能法测定,是美国国家临床检验标准委员会(NCCLS)推荐的Fib参考检测方法。其它方法还有通过自动化凝血仪测定血浆凝血酶原时间(PT),进而推算Fib含量的PT衍生法(PT-Der法)以及亚硫酸纳盐析法,热浊度法和免疫浊度法。
有的作者曾对五种检测血浆纤维蛋白原的方法进行了方法学评价,见表6。
从表6可以看出,5种方法的精密度均可,但准确度不一。PT-der法与Cluass法较为接近,热浊度法次之,其它方法相对误差均大于20%,亚硫酸纳盐析法甚至高达35.43%。
从表7中可以看出,PT-der法的测定结果与Cluass法结果接近,但热浊度法。免疫浊度法和亚硫酸纳盐析法检测的结果高于Cluass法结果。
从表8中可以看出,Fib正常范围,高值范围和低值范围,以Cluass法作为参考,分别与其它方法进行两均数(z
)配对t检验和回归分析,PT-der法和Cluass法差别最小。其它方法与Cluass法均有较大的差别。但是,高值组PT-der法则定的结果高于Cluass法测定的结果,两者有统计学的意义。另外,按PT-der法说明书上的规定,该法不能检测Fib<0.6g/L的标本。(以上表格材料引自程烽,朱忠勇,王丹等.5种纤维蛋白原测定方法的比较,临床检验杂志,2000,18:12-14.)
但是,更重要的是不能仅从方法学本身的精密度和准确度进行评价,必须从临床应用的角度进评价。
1.CLuass法是目前国内外最常用的常规方法。该方法操作简便快速,结果与Jocobsson法(WHO和NIBSC推荐的参考方法)相比相关性良好。但Fib的异质性,FDPs(如X,Y片段和D-二聚体等)以及存在肝素等抗凝剂时会影响其测定结果。
2.PT-Der法是在检测PT过程中演算出来的,更快速,简便的特点。但是其检测结果高于Cluass法的检测结果,有时失去可靠性,特别是在疾病状态下和溶栓治疗中。因为溶栓过程中,早,中期FDPs产物X,Y片段可产生一定的浊度,影响比浊,而晚期产物D,E片段,虽不产生浊度变化,但影响凝血酶时间(TT)的结果。上述两种方法的比较,见表9。
所以,我们测定纤维蛋白原的方法应当是选择Cluass法,而不是其它方法。也是美国国家临床检验标准委员会(NCCLS)和我们CCCLS推荐的Fib常规检测方法。
(四)血液流变学检查
关于这个问题,301医院胡金麟,李贵山,钱自奋等人在中华检验医学杂志2000年第5期上发表一篇《临床血液流变学常用指标检测规范化的建议》文章,可供参考。结合这篇文章,我谈点个人意见。
1.首先要对仪器性能进行评价
在选购血液粘度计时,或者在正式使用前应当对仪器进行准确度,分辨率和重复性进行评价。根据301医院专家的建议:(1)准确度评价应以国家计量标准油为准。在切变率1-200S-1范围内分别测定低粘度油(约2mpa.s)和高粘度油(约2OmPa.s)的标本,各测定5次以上。要求测定值与标准油的实际粘度的偏差<3%。(2)分辨率评价是指粘度计所能识别出血液表观粘度的最小变化值。可以取血球比积在0.40-0.45范围内的正常人全血标本，以自身血浆进行调节血球比积的变化,配制成不同比积的标本,分别在高、低切变率下进行测定。高切(200s-1)测定下,仪器能反映出0.02比积的变化;而在低切(1s-1)测定下,仪器能反映出0.01比积的变化。(3)重复性评价应取血球比积在0.40-0.45范围内的正常人全血标本,连续测定10次。高切下,变异系数<3%;低切下<5%。
2.定期对仪器的切变率进行校准
粘度计应当属于计量仪器,测定的准确性取决于仪器切变率的准确性,因此应当定期对仪器的切变率进行校准。按照设计原理,无论是悬丝法,还是锥板法仪器的切变率由转速决定,见表10。
见表10。
当然,关于转速的检测,必须由厂家或国家计量部门进行检测。
由于BV-100型悬丝法粘度计转速的精密度非常高,目前尚无校准仪器的,国家计算部门也正在研究此事,因为BV-100的市场不断扩大,校准手段必须解决。
3.开展室内室控,必要时开展室间质评。
血浆粘度不随切变率变化而变化,完全可以用标准油做质控物,每天随标本同时测定一个标准油进行室内质控。同样,也可以用标准油进行室间质评。要加紧对全血粘度质控品的研制。
{五}小结
我们应当按照ISI/E导则25,CCCLS(中国临床检验标准化委员会)发布的两个关于QA和QC《草案文件》的精神,认真制定上述检查项目的操作手册,或称为程序性文件,建立一个完整的、封闭的、有效运行的质量保证体系。
三、将检验数据转变为有临床价值的信息是我们今后工作的重点
我们检验工作是为临床服务的,因此我们必须把自己的工作与临床密切地结合起来,把检验数据转变为有临床价值的信息,也就是我们应当主动积极地参与临床的诊断、治疗、健康咨询等工作,绝不能再象以前那样游离于临床之外,单纯地、被动地做检验工作。
(一) 主动发挥我们的优势,为临床出主意,提建议,参与临床诊断、治疗工作。
1.运用血细胞分析仪多参数的优势,帮助临床解决临床问题
(1)贫血
这方面大家都很清楚,可以按照下面的程序,指导临床医生诊断贫血性疾病。
自动化血球分析仪检查一根据Hb一诊断贫血和贫血的程度一根据MCV(参考红细胞直方图曲线峰值移动),MCH,MCHC对贫血进行初步的形态学分型一根据RDW可以对贫血进行鉴别诊断(参考红细胞直方图曲线的宽度)一根据网织红细胞计数,鉴别增生性和不增生性贫血一必要时,应涂片观察红细胞形态和有无有核红细胞一如果考虑有溶血性贫血的可能,应做有关检查一做有关生化检查,如血清铁,VitB12和叶酸等一最后可考虑骨髓细胞学检查。
(2)感染
除了白细胞总数和分类计数外,应特别注意嗜中性粒细胞的核象和中毒性改变,因为后两者对判断感染的程度很有帮助。如果有条件,我们应当积极开展末梢血快速CRP的检查,对鉴别病毒性感染和细菌性感染很有意义。
2.运用尿液分析中的重要结果,帮助临床解决临床问题。
(1)蛋白尿分型和尿微量白蛋白检查
尿液检查是诊断和评价肾脏疾病的重要手段,其中尿蛋白的检查尤为重要。一旦发现病人有蛋白尿,就要进一检查蛋白的性质和来源,这对于肾脏疾病的鉴别诊断是非常重要的,见表11。
过去由于方法学的限制，蛋白尿的分型不能在临床广泛使用，现在，应用全自动特定蛋白分析仪，就可以对尿液标本进行蛋白的分析。尿液蛋白检测的项目，见表12。
根据对尿液蛋白的检查,我们可以做出实验室的临床结论,见表13。
这里特别要强调尿微白蛋白检查对糖尿病肾病的诊断意义。正常情况下尿中白蛋白的含量应在2Omg/L(白蛋白排泄率<20μg/min)以下。1982年Viberti等人发现1型糖尿病患者在尿中总蛋白含量正常时,而白蛋白排泄增加。因此,提出"微量白蛋白尿"的概念(Microalbuminuria)。微量白蛋白尿是糖尿病肾病的早期信号,反映全身微血管病变的程度,尤其是肾小球毛细血管通透性的指标。其特征是尿白蛋白浓度为20-200mg/L,(或白蛋白排泄率20-200μg/min,或30-300mg/24小时,或白蛋白/肌酐比率为30-300mg/g肌酐),此时尿常规试纸条法检测蛋白为阴性。(尿常规试纸条阳性时白蛋白浓度已经超过200mg/L)。
(2)尿红细胞形态
不管用那种方法能帮助临床鉴别出尿液中红细胞的形态是正常,还是异常,对血尿的鉴别诊断是非常有意义的,尿红细胞形态检查应当做为常规工作开展起来。如果以75%为数量标准的话,尿中红细胞形态以异常为主(如面包圈,蘑菇样,头盔样,碎片状或影形红细胞),则为肾小球血尿,临床上应考虑肾炎或肾病;如果以正常形态的红细胞为主,则为非肾小球血尿,来源于肾盂,输尿管,膀胱和尿道,临床上应考虑结石,感染(包括结核),肿瘤或外伤。
(3)尿白细胞形态
由于免疫性肾脏疾病发病增多以及肾移植已成为常规手术,如何区别免疫性肾疾病和泌尿系感染,以及如何判断肾移植后是否发生排斥反应,检查尿液中不同类型的白细胞是非常重要的。如果尿中白细胞中以嗜中性粒细胞为主,则为细菌性炎症;如是淋巴细胞和单核细胞为主,则为免疫性炎症,如狼疮性肾炎,肾移植后发生排斥反应。
3.运用凝血试验的数据,帮助临床解决诊断和治疗问题
(1)应当建立合理的检查程序
有关止血与血栓方面的检查内容非常多,而且往往相互交错,临床医生往往不知从何入手。我们应当帮助和指导他们设计检查计划。表14可供参考。
表14 止血和血栓性疾病实验室检验的检查程序
一、初筛试验
1.1期过筛试验
(1)出血时间测定(BT)
(2)血小板计数(PLT)
2.Ⅱ期过筛试验
(1)试管法凝血时间(CT)
(2)血浆部分活化凝血活酶时间(APTT)
(3)血浆凝血酶原时间(PT)
二、进一步试验
1.血小板疾病
(1)血小板聚集试验
(2)血小板相关抗本检查
(3)骨髓细胞形态学检查
(4)血小极活化分子标志物检查,如TXB2,PF4,GMP140
2.血管内皮细胞功能检查
(1)血管性血友病因子(vWF)抗原含量和活性测定
(2)瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验
3.凝血因子缺乏,如血友病
(1)纠正试验
(2)单因子抗原含量和活性测定
4.高凝状态分子标志物检查
(1)血浆纤维蛋白肽(FPA)
(2)血浆凝血酶原片段1+2(F1+2)
5.抗凝因子检查
(1)抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)
(2)蛋白C,活化蛋白C(APC),蛋白C抵抗现象(APCR)
6.纤维蛋白溶解系统因子检查
(1)组织型-纤溶酶原激活物(t-PA)
(2)纤溶酶原(PA)
应当告诉临床医生,遇见出血性疾病的患者应当按照一定的检查程序进行,而不是盲目地做所有有关检查。
应当告诉临床医生,初筛试验虽然简单,但其作用很大。应当重视对初筛试验结果的分析,在此基础上再有计划地安排进一步检查。
表15 I期止血过筛试验结果临床分析
| 检测结果 临床分析 |
| PLT减少,BT延长 各种原因所致的血小板减少症 PLT正常,BT延长 血小板功能缺陷,血管性血友病 PLT正常,BT延长 过敏性紫癜,单纯性紫癜 PLT增多,BT延长 临床上极少见 |
如果临床上考虑血小板功能缺陷或血管性血友病,我们应当建议做血小板聚集试验等相关检查。
表16 Ⅱ期止血过筛试验结果分析
| 检测结果 临床意义 |
| APTT延长,PT正常 内凝固子缺陷(如血友病),抗凝物质存在(如肝素,FVE抗体) APTT正常,PT延长 外凝固子缺陷(FV Ⅱ缺乏),抗凝物质存在(如口服抗凝剂) APTT和PT均延长 严重肝病,DIC,先天性或继发性纤维蛋白原减少,抗凝物存在 APTT和PT正常 先天性或继发性FX Ⅲ缺乏 |
表17 循环抗凝物存在与否的鉴别试验
| 实验方法 凝血因子缺乏 循环抗凝物存在 |
| APTT 延长 延长 加入50%正常血浆 再做APTT 能纠正 不能纠正 |
抗凝物包括:
①物理性抗凝物,如AT-Ⅲ和蛋白C系统活化;
②病理性抗凝物,如狼疮抗凝物,见于SLE等病人;
③药物,如肝素、华法令等。
如果临床上考虑血友病,我们应当积极配合临床进行纠正试验或单因子活性和抗原含量的测定。
(2)外科手术前有关止血机制的检查
卫生部发文停止使用Duke法的BT和玻片法的CT以后,外科医生最关心的是他们术前有关病人止血机制的检查如何进行?查那些项目?
用APTT可以代替CT测定;但是用TBT法代替BT测定,很不实际。BT属于I期止血过筛试验,是针对血小板和血管内皮的相关检查,无论是血小板的数量减少或功能缺陷,还是血管内皮分泌vWF缺陷,都可导致BT时间延长。如果患者有血小板减少,那查血小板计数便可清楚,也不需再做BT检查。只有血小板功能缺陷的疾病和血管性血友病(vWF缺陷),才可能出现血小板计数正常,而BT延长。这种患者在人群中发病率很低,而且一般都有家庭史,或有既往史,或者有出血倾向的体征,如皮肤出血点,瘀斑等,只要临床医生在手术前仔细地询问了病史,认真地做了体格检查,同时检查血小板计数正常,那么漏诊血小板病和血管性血友病就几乎不太可能。所以,我们认为没有必要将TBT法的BT测定列入手术前的常规检查。国外的大量临床统计也证实了这一点,所以,在国外外科手术前也不常规检查BT。因此,手术前除外出血性疾病的常规检查是血小板计数,APTT,PT测定三项。但是,病史和体检应当重视。
(3)指导抗凝和溶栓治疗
(A)抗凝治疗的实验室监测
(B)实验室监测
a.活化部分凝血活酶时间(APTT)
正常对照的1.5-2.5倍
b.活化凝血时间(ACT)
参考值:75-125秒
控制范围:400-600秒
c.血浆肝素治疗浓度以0.3-0.8u/ml为宜。
d.凝血酶时间(TT)
参考范围:16-18秒
肝素治疗后时间延长。
e.抗凝血酶活性测定(AT：ⅢC)
采用发色底物法。
参考范围:85%-135%
肝素抗凝后其活性应增高,如果
<70% 肝素抗凝效果减低
<50% 肝素抗凝效果明显减低
<30% 肝素抗凝失败
f.血小板计数(PLT)
由于普通肝素治疗带来的出血并发症始终较高,大约是7%-23%,因此近年来,更多的临床医生转向使用低分子量肝素。
低分子量肝素的实验室监测不能使用APTT,应使用:
血浆肝素浓度测定(抗Xa)
凝血法(Heptest试验)
末梢全血:10.4±1.3
血浆:17.1±2.1
控制范围:正常对照的4-4.5倍
(C)溶栓治疗的实验室监测
提示溶栓治疗有效的指标
1.DD明显上升
2.FDP明显上升(>300mg/L)
3.α2-AP<30%
4.Fbg+1.2-1.5g/L
5.TT为正常对照的1.5-2.5倍
提示会发生出血的指标
1.Fbg≤1.09g/L
2.PLT≤5O×109/L
3.APTT为正常对照的2.0倍以上
(二)应当按照循证检验医学的原则,对检验项目,特别是新的项目进行科学的评价,然后才能推广到临床常规工作中。
卫生部在10年前以部长令的形式淘汰了一批检验方法,去年又发文通知全国废止Duke法的出血时间测定和玻片法的凝血时间测定。这都是按照循证检验医学的原则进行的。
循证检验医学的目的,就是要把最有临床诊断、治疗意义的检验项目和方法推荐给临床,而淘汰那些没有临床诊断和治疗价值的项目和方法,对临床诊断和治疗检测特异性和灵敏度都不高的项目和方法,应慎重采用。
过去我们往往仅从我们检验技术本身来评价一个方法、试剂和仪器(严格讲是一个检测系统),往往忽视这个项目和方法的临床应价值。今后我们应加强这方面的工作。
我们所做的化验结果,除骨髓细胞不检查之外,都属于一类不能决定诊断的辅助性检查,因此,结果的判断必须结合临床,结合具体病人,诊断学理论上讲,属于三值逻辑,即有病、无病和不能判定。这就必须进行结果预示值(Predictive value)的分析。
结果预示值可以回答临床医生很关心的三个问题:(1)一项试验结果对预测被检查是否有病或无病有多大可能性?(2)如果某项试验结果异常,其预示有病的概率有多大?(3)如果结果正常,预示无病的概率又有多大?
常的结果预示值有,诊断灵敏度(Diagnostic sensitivity),诊断特异性(Diagnostic specificity)和患病率(Prevalence)以及阳性预示值(PV+),阴性预示值(PV-)和实验有效率。
首先我们应当进行原始资料的统汁,设立下表,简称"四格表"(表17)。
显然,我们希望一项目检查项目上述所有预示值都达到最高,但实际上并不可能,只能做到相对满意的预示值。同时还有注意患病率对预示值的影响。
ROC(Receiver Operating Characleristiv),原意是接受机工作特性。这是因为该分析方法最初用于通讯学。ROC曲线反映的是某种检验项目的灵敏度与特异性之间的关系。做图时,纵坐标是灵敏度-真阳性率(TPR),横坐标是(1-特异性)-假阳性率(FRP)。如果曲线越向左上偏,曲线下的面积越大,其识别能力也就是临床准确性越高。
最近,在临检专业方面新的检查项目不断推出。比如,尿液Cystatin C(γ-痕迹蛋白)检查可早期诊断肾功能不全,甚至可以了取代血清内生肌酐清除率;尿液膜蛋白原-2可以提高对急性膜腺的诊断率,如果和尿液淀粉酶联合检查效果更好;粪便中幽门弯曲菌抗原的检查可以帮助临床诊断此菌感染引起的消化道疾病。此外,精液,脑脊液,胸腔积液的检查上也有新的项目推出。这些项目的推出无疑是对检验工作的推动和发展,但也一定
要注意认真地评价它们的临床应用价值,不可盲目开展。
四、芯片技术的发展给临床检验带来了新的发展。
一个若干cm2大小的硅片上面有规律地排列了成千上万个寡核苷酸探针,依照核酸杂交原理,芯片上探针与被检样品中靶分子杂交(DNA或RNA杂交),然后用激光共聚焦显微镜检查杂交发出的荧光或化学发光信号,用计算机对这些杂交信号进行处理,就可以导速得到检查结果。这就是DNA芯片技术。
在此基础上,蛋白质,细胞,甚至组织都可以固化在芯片上,就构成了一个芯片实验室,又称微缩实验室(Lab-on-a-chip),可以将实验中令人棘手的样品处理,PCR扩增,DNA酶切,竞争性免疫分析,毛细管电流泳,甚至质谱分析等系列操作都集中在一块2cm2大小的芯片上进行,据说,美国Nanogen公司已经开发出世界上第一块微缩实验室芯片模型。
但是,无论检验技术如何发展,自动化仪器如何普及,就是到了芯片实验室时代,检验的准确性,灵敏性和临床应用性始终是检验医学最根本的东西,也就是说,规范化管理,标准化操作,严格的质量保证体系永远是我们研究的主题。
总结
根据ISO/IEO导则25和CCCNS标准化的要求,建立规范化的操作和质量保证体系,不仅为临床提供准确,及时的检查报告,而且积极参与临床疾病的诊断、治疗、预防和咨询的工作,这就是我们在新世纪努力的方向。
