曾令兰  高  勇  罗端德  蔡淑清 
    反基因技术是利用三链DNA的构建而实现的。三螺旋形式寡核苷酸(TFO)以DNA双螺旋为靶物，通过与序列形成三螺旋DNA来阻止基因转录。我们在证实TF020在体外能够有效地抑制HBV复制的基础上，为研究TF020在体内对HBV复制的影响及对机体可能产生的副作用，我们将HepG2.2.15细胞接种裸鼠背部皮下制备能够分泌HBV毒粒的动物模型，用TF020局部注射肿瘤部位，再检测裸鼠血清中HBV DNA及HBV标志物以分析TF020在整体水平对HBV复制的抑制作用，其中HBV DNA下降101．59拷贝／m1，HBsAg及HBsAg抑利率分别达到21.8％和52.5％；并通过病理切片观察裸鼠肿瘤及肝脏组织的结构形态，明确TF020对肝脏的毒性作用。 
    一、实验材料 
    (1)裸鼠：5周龄，购自中科院上海药物的重约16克／只，共22只。 
    (二)HepG2．2．15细胞：为HBV DNA克隆传染人肝癌细胞HepG2的2.2.15细胞系，由美国MountSinai医学中心构建。该细胞系整合了HBV的全基因组，可分泌HBsAg，HBeAg及完整的Dane颗粒。 
    (三)TF020吸ODNcon：TF020序列为5，—CTCCTCCCCCAACTCCCTCCC—3，对照寡核苷酸(ODHcon)碱基组成与TF020一致，方向相反，序列为5，—CCCTCCTCAACCCCCTCCTC—3，。为便于检测，将二者进行了生物系标记；为防止其细胞内的DNA酶类裂解，将二者进行了硫代修饰(由上海生物工程有限公司协助完成)。 
    (四)主要试剂：1．TrizoL提取试剂盒(Ute&Technologies公司)；2．逆转录酶M—MLV(Gibco公司)；3．Oligo—dT(Gibco公司)；4．RNA酶抑制剂(RNasin,Promega公司)；5．荧光定量RCR试剂盒(BiotronicsTech．Corp)。 
    (五)试剂配方(略) 
    (六)主要仪器(略) 
    二、实验方法 
    1．培养、收集HepG2．2．15细胞 
    用含G418(400毫克／m1)及10％胎牛血清的DMEM在37摄氏度5％C02条件下培养该细胞系，每隔3—4天换一次新鲜培养基；当培养瓶中细胞长满时，用0.25％胰蛋白酶消化后收集，用PBS离心(1000rpm)洗2X5min。 
    2．饲养裸鼠 
    5周龄裸鼠22只，均为雌性。由华中科技大学同济医学院实验医学动物部负责饲养，恒温18-22摄氏度，恒湿50-80％，密闭无菌环境，自由摄取无菌水和灭菌标准饲料。 
    3．动物模型的建立与验证 
    将HepG2.2.15细胞悬液注入裸鼠背部皮下，每只约5*10000000细胞，以建立裸鼠皮下肝癌模型。每周用卡尺测量肿瘤长、宽、高，待肿瘤长至0.8cra大小时，开始实验。将其中长有肿瘤的裸鼠处死，取其血清分别用ELISA和PCR法检测其中的HBsAg、HBeAg与HBV DNA。 
    4．TF020干预 
    将上述裸鼠模型随机分为二组，治疗组12只，对照组6只。将脂质体—TF020复合物局部浸润注射治疗组裸鼠的肿瘤部位，治疗组每只裸鼠每次注射的量为200毫克(含TF0204ng)，共2次，间隔48小时。对照组于同一时间给予与治疗组等量的脂质体作对照。 
    5。裸鼠血清、肿瘤及肝脏采集 
    第二次注射后第48小时经颈处死裸鼠，眼眶采血，离心收集血清，置70摄氏度备用；切取肿瘤和肝脏组织，行常规石蜡包埋切片。 
    6。ELISA法检测TF020对HBV复制的影响 
    将采集到的裸鼠血清用ELISA方法检测HBsAg及HBeAg含量。 
    7．荧光定量PCR检测TF020对血清HBV DNA水平的影响。 
    采集裸鼠血清用荧光定量PCR检测HBV DNA。HBV DNA荧光定量PCR结果采用求对数平均值的方法计算HBVDNA的平均拷贝数。 
    操作方法(略) 
    8．统计学处理实验数据以天土s表示，组间均数的比较采用t检验。 
 三、结果 
    1．动物模型的建立与验证 
    HepG2．2．15细胞接种裸鼠背部皮下5天后即可在接种部位触及肿块，10天后肿块长至约0.5cm大小(见图1、2略)。成瘤率为90．9％(20／22)。瘤体呈实体团块状。肿瘤病理切片显示瘤体内见大量的癌细胞(见图3略)。长有肿瘤的裸鼠血清中HBsAg及HBeAg及HBV DNA的检测结果均呈阳性。 
    2．TF020对血清HBsAg及HBeAg的影响 
    经酶联免疫吸附法(ELISA)检测，结果见表1。治疗组裸鼠血清中HBsAg及HBeAg分泌量较对照组明显降低，抑制率分别为对21.8％和54.0％(见表1)。 
    4．脂质体—TF020的毒性作用治疗组和对照组肿瘤病理切片显示有局灶性坏死，并伴有炎性细胞浸润(见图4略)。三组裸鼠肝组织大体观均正常，病理切片显示肝脏结构无明显变化，肝细胞形态无明显异常(见图5)。 
    四、讨论 
    HBV宿生范围狭窄，且有明显嗜肝性，建立合适的HBV感染动物模型很困难。目前常用的HBV感染动物模型各有其优点和不足。HBV感染黑猩猩模型已得到公认，但其来源困难，数量有限，价格昂贵；HBV全长片段的转基因小鼠有病毒DNA复制及蛋白合成的能力，能够产生较高水平的血清HBsAg及HBeAg，血清中可测到HBV DNA[1]。利用HBV转基因小鼠模型可直接检测HBV免疫学及致病机理，并可作为抗病毒药物评价的体内模型。但是该模型用于本实验有一定的限制，主要是由于HBV广泛存在于小鼠的各种组织细胞中，TF020难以充分发挥作用。鸭肝炎模型虽然可以阐明人肝细胞感染HBV的许多问题，但是DHBV的基因结构和功能与HBV存在较大的差异，而树鼯的HBV感染多呈急性过程，在感染2—3周内，血清中很快出现高水平HBcAg及HBsAg，因而都不是理想的HBV感染动物模型(2)。 
    本研究用HepG2．2．15细胞接种裸鼠背部皮下制备能分泌HBV的动物模型，结果显示裸鼠的血清中可以检出HBsAg、HBeAg及HBV DNA。该模型具有易于控制、操作简便的优点，且所需用药量较小。本研究发现脂质体—TF020在动物的整体水平上具有一定的抑制HBV复制的作用，可以明显降低裸鼠血清HBsA、HBeAg及HBV DNA的水平，对HBsAg及HBeAg抑制率最高分别达到21.8％和52.5％，HBVDNA则下降101.59拷贝／ml。但是与体外实验结果相比，抑制作用均有所减弱，分析原因可能为：①裸鼠皮下实体型的肿瘤组织对脂质体一TF020复合物摄取有限，而体外培养的细胞为单层，与TF020的接触面积大，因而易于摄取；②与肿瘤的增长有关，由于HBVDNA整合到HepG2.2.15细胞的染色体中，随着细胞数量的增加HBV分泌的基础水平必然升高。当然，机体其它的一些影响因素也不能排除。 
    本实验还发现利用脂质体包裹TF020可以引起肿瘤组织的局灶性坏死，并与加人的脂质体—TF020复合物的剂量相关，结合体外实验中观察到的加入一定量脂质体TF020后细胞脱壁、死亡的现象，指示脂质体作为TF020的传染介质具有一定的毒性作用。因此，如何降低脂质体的毒性作用，尚需进一步研究。

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