曾爱华 何蕴韶 作者单位：510080 广州，中山大学基础医学院人体解剖学教研室（2002级博士研究生）
[摘要] RNA干扰是指外源dsRNA引发生物体内基因的同源序列降解，从而表现出的基因转录后沉默现象。它是基因功能组学研究的有效手段，具有高效性、高特异性、高稳定性等作用特点。。
[关键词] RNA； 干扰； 基因组学
将与内源mRNA序列相对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞，可使内源mRNA降解和基因沉默，这种转录后基因沉默机制(post transcriptional gene silencing,PTGS)被称为RNA干扰(RNA interference, RNAi) [1]。近几年来，由于RNAi具有和基因敲除相媲美的功能，人们对它的研究越来越热，也越来越深入。本文现将它的研究及应用进展作一综述。 1 RNA干扰的历史研究和发现过程 RNAi是一种植物、昆虫、原生动物等抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。 1990年，Richjorgensen等试图将能产生色素的基因导入矮脚牵牛(petunias)中来加深花朵的紫颜色，结果不但没看到深紫色花朵，反而多数花出现了全白或部分白色，这种现象为共同抑制(cosuppression)[2]。后来，Cogoni等发现将合成类胡萝卜素所需的基因导入粗糙红色链孢霉菌，引起约30%的细胞自身基因失活，并将其称之为基因的压制作用(quelling)[3]。 1995年，康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues用反义RNA去阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中的par1基因的表达时，发现反义RNA能够阻断par1基因的表达，但是正义链RNA同样也阻断了基因的表达[4]。直至1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才证实，Guo博士发现的正义RNA抑制基因表达的现象是由于体外转录的RNA中污染了微量双链RNA而引起，并发现双链RNA（正义链和反义链的混合物）具有比正义链或反义链都要强得多的基因沉默效应，他们将这一现象首次称为RNAi。这种双链RNA导致的RNA干扰现象随后在昆虫、锥虫、果蝇、涡虫、斑马鱼、真菌、植物拟南芥等生物及哺乳动物细胞株中也分别被发现。 2 RNAi的可能机制 干扰性小RNA (small interfering RNA或shorting interfering RNA,siRNA)是RNA干扰作用得以发生的重要中间效应分子。siRNA是一类长约21～25个核苷酸的特殊dsRNA分子,它的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性[5]。dsRNA是诱导细胞RNAi的关键组分，外源DNA、RNA序列均可激发细胞产生相应的dsRNA，但产生的方式不同。 dsRNA在Dicer 酶作用下解旋裂解形成21～25个核苷酸的siRNA。siRNA可以是外源性的，也可以是内源性的。由siRNA中的反义链指导形成一种沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC), RISC对靶mRNA具有识别和切割作用,利用结合在其上的核酸内切酶切割靶mRNA分子中与dsRNA反义链互补的区域，形成了21～23个核苷酸长的dsRNA小片段,从而达到干扰基因表达作用[6]。 3 RNAi的作用特点 ① 高效性：少量的dsRNA就可以有效地抑制基因表达,比基因敲除技术更快更简单。 ② 高特异性：小干扰RNA只会使靶基因失活，对其它基因没有沉默作用。 ③ 高稳定性：以3′端悬垂TT或UU碱基的双链RNA比较稳定,不再需要进行任何其他的修饰。 ④ dsRNA的浓度依赖性：dsRNA诱发的RNA干扰效应的强度随着其浓度的增高而增强[7]。 ⑤ RNAi的时间效应性：RNA干扰在注入dsRNA的2～3天后的作用最强；而随后的1～2天内,靶mRNA的丰度就能恢复到干扰以前的水平[8]。 ⑥ RNAi的遗传性：Fire等人发现线虫中RNA干扰可以传代。 ⑦ RNAi对细胞调控机制的影响性：RNA干扰在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身的调控系统没有影响[9]。 4 RNA干扰在基因治疗上的历史突破 由于双链RNA可以在转录及转录后水平抑制基因表达，从而使我们可以利用RNAi技术通过抑制癌基因功能实现基因治疗。但以前将长度大于30bp 的siRNA导入哺乳动物细胞培养株时却不能观察到特异的RNA干扰现象——细胞的基因表达全面被抑制和发生细胞凋亡的现象。后德国科学家Elbashir等发现，小的21个核苷酸的双链RNA可使哺乳动物细胞的基因表达明显降低，从而使RNAi技术可用于人类基因功能研究以及疾病基因治疗。接着，Brummelkamp等采用19个核苷酸接上一个发夹形环状的dsRNA结构克隆入pSUPER质粒载体，并能形成发夹状shRNA (small hairpin RNA), shRNA在体内转变成21个核苷酸长度的siRNA样的分子从而引起RNA干扰。另一种siRNA表达载体在pol Ⅲ启动子作用下编码siRNA链,这两种载体的沉默功效可以比较长久，非常适合对癌基因或病毒的治疗[10]。 5 制备siRNAs的方法 由于RNA干扰在基因组学研究方面具有和基因敲除相似的作用，因此国外很多研究机构纷纷把研究重点投向RNAi技术，现已形成了一整套研究RNAi的技术方法：①化学合成；②体外转录；③长片段dsRNAs经RNase Ⅲ 酶类降解；④siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNA；⑤PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。前面3种方法是先在体外制备siRNA，然后经过转染或电转导入哺乳动物细胞。后面两种方法则依赖能够表达siRNA的DNA载体或者表达框转染到细胞中。这5种制备siRNAs的方法能适合不同的研究要求和目的。化学合成是成本最贵的却又是最有效的方法，它适用于已经找到了最有效的siRNA，需要大量siRNA进行研究的情况。体外转录的方法合成siRNA成本比较低，能够比化学合成法更快得到siRNA，它适合于筛选siRNA这种情况。用RNaseⅢ 酶消化长片段双链RNA来制备很多的短双链siRNA，这种方法适用于快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。siRNA表达载体法是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法，带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达。siRNA表达框架法(siRNA expression cassettes，SECs)是由PCR得到的siRNA表达模板直接导入细胞进行表达，该法最适用于筛选siRNA序列和在克隆到载体前筛选最佳启动子 [11～13]。 6 RNAi技术中的一些注意事项 6.1 dsRNA序列的选择 dsRNA主要选靶基因cDNA的开放阅读框架(ORF)区域，最好在起始密码子下游的50bp-100 bp 左右，dsRNA序列中的GC含量在40%～60%比较好,应避免选择包括5′或3′端的非翻译区域、内含子区域及多聚鸟苷酸序列区(≥3个)。选择前还应搜索BLAST数据库,确认不会引起其他相似基因的沉默作用。 6.2 dsRNA的导入方法 不同的生物体可以选择不同的导入方法，简单生物可选用电穿孔的方法；较复杂生物可选用dsRNA微注射法等。目前的RNAi研究还常以高效转染试剂、质粒或病毒为载体,通过转染或转导途径,得到很好的RNAi效应[14]。在哺乳动物中诱导RNA干扰必须是21个核苷酸左右的siRNA,而且其抑制效果不如在低等生物中表现的好。 RNA干扰也存在一些缺点,如易被降解,细胞摄取效率低等。 7 RNAi的应用及发展前景 7.1 应用RNAi研究基因功能通过RNAi特异性抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的特定功能。到目前为止,已经利用RNAi技术在线虫、果蝇、昆虫、真菌、植物及哺乳动物细胞中相继鉴定了一大批新基因的功能[15]。 7.2 在基因药物的研制与开发方面根据 21个寡核苷酸siRNA能够抑制同源mRNA的表达,可以人工设计合成外源性的21个寡核苷酸siRNA进行相关癌基因的药物治疗，治疗那些现有药物不能很好解决的疾病如SARS、艾滋病、各种肿瘤和遗传性疾病。 7.3 RNAi作为一种研究病毒的新技术 Shlomai等用RNAi抑制细胞培养物中HBV病毒复制，并转染siRNA到免疫活性及免疫缺陷小鼠中来抑制HBV病毒复制，结果显示RNAi显著减少了HBV的复制水平，HBsAg在细胞培养和小鼠血清中分别减少了94.2%和84.5%，肝细胞中的HBcAg下降了99%[16]。此外,RNAi在对流感病毒A[17]、人免疫缺陷病毒 [18]、丙型肝炎病毒 [19]、人乳头瘤病毒的研究中也有应用，并取得了较好的结果。 7.4 RNAi在基因治疗中的作用人们可以根据同一基因家族的多个癌基因具有同源性较高的保守序列这一特点,设计针对这一保守序列的dsRNA分子,只导入一种dsRNA就可以产生多个癌基因同时被抑制的现象。RNAi用于肿瘤基因治疗还处于摸索和积累阶段，目前已有相关的研究报道。比如，脂肪酸酶（FASE）在很多人类上皮癌中过分表达，De Schrijver 等用RNAi技术减少了FASE的表达，并使前列腺癌细胞发生凋亡[20]。Wilda等在白血病细胞K562试验中,用对M-BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染K562细胞,发现K562细胞中相应的mRNA被清除,并出现强烈的细胞凋亡现象[21]。还有国外学者应用RNAi成功地抑制了表皮生长因子（erbB1）、血管内皮生长因子（VEGF）和Bcl-2的表达[22]，并用RNAi对白血病、结肠癌等进行了研究，取得了一定的成绩[23]。总之, RNA干扰在各种基因沉默现象中所起的巨大作用预示着RNAi不但是研究基因功能的一种有力工具,而且为特异性基因治疗提供了新的技术手段，RNA干扰技术具有巨大的科研价值和社会经济价值。 参考文献 [1] Fire A,XU AQ,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdits elegans. Nature,1998,391:744. [2] Napoli C,Lemieux C,Jorgensen RA.Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell,1990,2:279. [3] Cogoni C,Romano N,Macino G..Suppression of gene expression by homologus trans- genes.Antonie Van Leeuwenhoek,1994,65:205. [4] Guo S,Kemphues KJ.Par-1,a gene required for establishing polarity in C.elehans embryos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed Cell, 1995, 81:611. [5] Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi: double-strande RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals.Cell,2000,101:25. [6]Hammond SM,Bernstein E,Beach D,et al.An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.Nature,2000,404: 293. [7] Irie N,Sakai N,Ueyama T,et al.Subtype and speciesspecific knock down of PKC using short interferenceing RNA.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 298:738. [8] Sui G,Soohoo C,Affar el B,et al.A DNA vector based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci. USA, 2002,99:5515. [9] Holen T,Amarzguioui M,Wiiger MT,et al.Positional effects of short interfering RNAs targeting the human coagulation trigger tissue factor.Nucleic Acids Res,2002,30:1757. [10] Paddison PJ, Caudy AA, Hannon GJ. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA ,2002,99:1443. [11] Brummelkamp TR,Bernards R,Agami RA.System for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.Science,2002,296:550. [12] Paul CP, Good PD, Winer I et al. Effective expression of small interfering RNA in human cells.Nature Biotechnology,2002,20:505 . [13]Castanotto D,Li H,Rossi JJ.Functional siRNA expression from transfected PCR products.RNA, 2002, 8: 1454. [14] Shuey D,McCallus DE,Giordano T.RNAi:gene silencing in therapeutici intervention Drug Discov Day,2002,7:1040. [15] Hughes CL,Kaufman TC.RNAi analysis of deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug oncopeltus fasciatus:novel roles for Hox genes in the Hemipteran head.Development, 2000,127:3683. [16]Shlomai A,Shaul Y.Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference. Hepatology, 2003,37:764. [17] Ge Q,McManus MT,Nguyen T,et al.RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription.Proc Natl Acad Science, 2003,100:2718. [18] Martinez MA, Gutierrez A, Armand-Ugon M, et al Suppression of chemokine receptor expression by RNA interference allows for inhibition of HIV-1 replication. AIDS,2002,16:2385. [19]Milner J. RNA interference for treating cancers caused by viral infection.Expert Opin Biol Ther, 2003, 3:459. [20]De Schrijver E, Brusselmans K, Heyns W,et al. RNA interference-mediated silencing of the fatty acid synthase gene attenuates growth and induces morphological changes and apoptosis of LNCaP prostate cancer cells.Cancer Res. 2003,1;63:3799. [21]Wilda M,Fuchs U,Wossmann W,et al.Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion gene by RNA interference(RNAi).Oncogene,2002,21:5716. [22]Nagy P, Arndt-Jovin DJ, Jovin TM. Small interfering RNAs suppress the expression of endogenous and GFP-fused epidermal growth factor receptor (erbB1) and induce apoptosis in erbB1-overexpressing cells. Exp Cell Res,2003,15;285:39. [23]Zhang L, Yang N, Mohamed-Hadley A,et al. Vector-based RNAi,a novel tool for isoformspecifi knock down of VEGF and anti-angiogenesis gene therapy of cancer. Biochem Biophys Res Commun,2003,18;303:1169.
