[关键词] 荧光定量PCR，HBV DNA
HBV DNA检测方法有直接杂交法，bDNA信号扩增技术及PCR-ELISA等[1-3]，它们由于灵敏度、试剂成本高或易导致交叉污染等原因，不能满足临床日常的需要，本文利用Taqman技术，建立HBV-DNA荧光定量PCR检测方法,并进行了方法学评价以及初步临床应用。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 乙型肝炎血浆标本来自本院感染科和消化内科的住院和门诊患者；正常血浆标本来自本院输血科;用PCR专用管收集血液，EDTA抗凝，分离血浆，置－20保存或立即检测。
1.1.2 引物与探针 PCR引物(P1、P2)为一对HBV S区基因特异引物，扩增该区片段长144bp， P1：5′–ATCAA CTACCAGCACGGGAC-3′(20bp),P2：5′– AGTTTCCGTCCGAAGGTTTT-3′(20bp),杂交探针P3：5′-(6-Fam)-TTCCTCTTC ATCCTGCTGCT(Tammra)(Phosphate)-3′。
以上探针和引物用Primer3软件设计，经Genbank校对后证实为HBV特异性序列并为在HBV各型共有序列，由新加坡Genset公司合成。
1.1.3 质粒DNA纯化试剂盒、UNG酶（尿嘧啶DNA糖基酶）由Fermentas公司提供；Taq酶、dUTP、dNTP、PUCm-T载体克隆试剂盒、质粒提取试剂盒由上海生工生物工程公司提供；X-gal、IPTG由BBI公司提供。 1.1.4乙型肝炎两对半测定,上海科华试剂，按厂家提供的说明书进行操作和判断结果。
1.1.5 仪器 Lightcycler荧光PCR扩增仪（Roche公司），振动培养箱，低温离心机等。
1.2. 方法 1.2.1 血浆HBV核酸提取 采用PEG沉淀提取法 ，方法为100μl血清标本与100μl PEG沉淀剂充分混合，13000r/min×10min离心，弃上清，沉淀物中加入25μl裂解液打匀，煮沸10min，经13000r/min×10min离心后，取3μl上清液作为PCR扩增模板液。
1.2.2 标准品的克隆 用高保真PCR扩增系统扩增PCR产物，经质粒DNA纯化药盒纯化后，与PUCm-T载体经T4 DNA连接酶连接, 转化DH5α菌株，在含X-gal，IPTG，氨苄青霉素的LB平板上筛选白色转化子菌落，增菌后用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经pstI酶切电泳和DNA测序证实为144bp目的DNA片段（另文报道），提取质粒DNA, 用确定含量的HBV-DNA血清校正其含量，配成不同浓度作为标准品使用。
1.2.3 荧光实时定量PCR试剂配制 P1 、P2 0.3mmol/L，P3 0.025mmol/L，Mg2+4mmol/L，dATP、dCTP、dGTP、dUTP 200mmol/L，TaqDNA聚合酶6U/100μl，UNG酶5U/100μl，用Tris-HCl pH 8.6 缓冲液配制。
1.2.4 荧光定量PCR检测 在毛细反应管中加入PCR反应液17μl，加入3μl模板提取液，经低速离心后，置Lightcycler扩增仪中进行扩增。扩增条件为：37℃×3min , 93℃×1min;92℃×5sec,60℃×30sec,40个循环;每次延伸结束时检测F1通道的荧光强度（F1通道参数设为4）。
1.2.5 结果计算 调整基线以试剂空白和阴性管不出现阳性为准，一般基线在0.1~0.3之间，与基线的交点的循环次数（Ct）值为纵坐标，HBV DNA浓度的对数值为横坐标，制作标准曲线，利用待测标本的Ct值求出相应的HBV DNA含量。 1.2.6 数据分析 定量结果对数值计算HBV DNA平均拷贝数及相关统计学分析，采用SPSS10.0 for Window 软件包处理获得的试验数据。以P<0.05差异具有显著意义。
1.2.7 质量控制 为增加数据的可信度，每次实验均设置空白对照管，已知量靶序列的临界值对照管及阴性对照管。
2. 结果 2.1方法学评价 2.1.1重复性 分别用3个不同HBV DNA含量的血清标本连续4 d分别测定HBV DNA浓度，其批内误差为1.8%～6.5％，批间误差为2.6%～9.1％，低拷贝标本的变异系数(CV值)较大,而高拷贝标本则较小。
2.1.2灵敏度 用罗氏试剂盒检测确定HBV阳性血清（1.4E+7 拷贝/ml），用HBV阴性血清1:5倍连续稀释，其检测灵敏度为800拷贝/ml。
2.1.3线性范围 用重组HBV质粒经确定HBV DNA含量的阳性血清校正后，用Tris-HCl缓冲液分别进行1:10稀释，以拷贝数的对数值为横坐标，以Ct值为纵坐标，进行线性回归。结果显示，在104～1011拷贝／ml之间,具有很好的相关性,回归方程为: Ct= -1.3911Ln(x) + 41.65，相关系数r=-0.9958。
2.1.4 特异性 用HBeAg（＋）的血浆标本用本法均能检出阳性拷贝数，而HCV-RNA（+）、EBV-DNA（+）、巨细胞病毒抗体IgM（+）、风疹病毒IgM（+）、TB-DNA（+）、和62例献血者血浆的标本用本法检测均为阴性结果。
2.2 临床应用评价
2.2.1外周血中HBV DNA定量检测与HBV标记物相关性 对331例本院就诊的住院或门诊乙型肝炎患者和62例来自本院输血科健康献血员外周血中HBVDNA进行定量检测和乙型肝炎两对半指标进行定性检测，结果见表1。
2.2.2 外周血HBV DNA定量检测在乙型肝炎治疗监测中应用 目前乙型肝炎患者外周血中HBV DNA定量检测主要用于乙型肝炎患者治疗（如贺普丁和干扰素等）的疗效观察及指导临床用药；从日常检测中选择了两例比较典型的病例进行了分析，病人1为一例乙型肝炎急性期患者，经贺普丁治疗其外周血中HBV DNA含量显著性下降，4个月后HBV DNA含量降至1.0′104拷贝／ml左右，改用干扰素治疗，6个月后检测不到HBV DNA病毒，此后相继出现HBcAb、HBeAb、HBsAb阳性,治疗效果极佳;病人2为患白血病的乙型肝炎患者,贺普丁治疗效果不佳。
3.讨论
外周血中乙型肝炎病毒的定性和定量检测是病毒复制最直接和可信的指标，因此定量检测外周血中HBV DNA含量对乙型肝炎的诊断，特别是病情监测、评价抗病毒疗效以及指导用药方面具有重要意义。本法建立的荧光实时定量PCR技术在常规的PCR技术的基础上加入荧光素标记的探针，在5ˊ 端上标上6-羧基荧光素（Fam），3ˊ 端标上6-羧基四甲基碱性蕊香红（Tamra），利用TaqDNA聚合酶5ˊ 端水解酶，使在延伸时切断5ˊ 端上Fam，阻断了5ˊ~3ˊ 荧光素的能量转移过程，能够检测到Fam所发出的荧光，其荧光强度与其时的产物量成正比。通过荧光强度的检测代表PCR产物的量，即Y = x′（1+E）n， lnY = lnx + n ′ln（1+E）， lnx = lnY-n ′ln（1+E） ，通过调整基线，lnY常数（b），ln（1+E）为相对常数（a）， lnX = b-n′a ，n即为Ct值，利用阳性梯度标准品的Ct和其浓度的对数值呈线性关系。本实验结果可以看出，Ct值和ln（x）之间具有很好的相关性（r =－0.9958），这也证实用Ct值进行定量的可信性。通过方法学评价可以看出，本法具有很好的重复性、特异性和较高的灵敏度（800拷贝/ml）和较宽的线性范围（103～012拷贝/ml）。使用重组HBV质粒作为实验标准品具有稳定性好，重复性好，扩增效率高等特点。
我们在建立了高灵敏的HBV DNA荧光 定量PCR技术的基础上，对331例本院就诊的住院或门诊乙型肝炎患者和62例来自本院输血科正常献血员血浆HBVDNA进行定量检测，结果发现，HBVDNA荧光定量PCR检测在临床乙型肝炎基因诊断，特别指导临床用药和治疗监测方面具有重要意义。
